[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101676719A [43]公开日2010年3月24日
[21]申请号200810141405.1[22]申请日2008.09.19
[21]申请号200810141405.1
[71]申请人河南瑞驰生物科技有限公司
地址454750河南省孟州市湘子路工业区
[72]发明人张志刚 崔跃远 马歌丽 魏泉增 [74]专利代理机构郑州中原专利事务所有限公司代理人张绍琳
[51]Int.CI.G01N 33/50 (2006.01)G01N 21/25 (2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 13 页 附图 2 页
[54]发明名称
[57]摘要
一种用分光光度计测定糖化酶活力的方法，属
于生物化学分析领域。用分光光度计来测量由糖化
应对波长为520nm光的吸收，来确定糖化酶酶活。
该方法包括梯度样品的制作、梯度样品吸光度的测
定、待测糖化液的制备、空白液制备、酶活力的测
定。此方法简单，快速，灵敏度高，准确及时地指
导糖化酶工业化生产。
200810141405.1权 利 要 求 书第1/2页 1.一种用分光光度计测定糖化酶活力的方法，其特征在于它是按以下步骤进行的：
(1)梯度样品的制作：称取已知酶活的液体糖化酶，定容配制成浓度为0.0020～0.0030g/mL的糖化酶溶液，取至少5个比管，分别加入20～30mL质量浓度为1.5～2.5％的淀粉溶液和3～8mL pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，分别加入0～2mL的蒸馏水后摇匀40℃水浴预热5～10min；5个试管中蒸馏水的添加量呈梯度变化，向上述比管中分别加入糖化酶溶液，开始计时，反应25～35min，分别向每个比管中添加0.2～0.5mL质量浓度为20～25％的NaOH溶液，摇匀，迅速用水冷却，终止酶反应； (2)梯度样品吸光度的测定：分别吸取步骤(1)得到的反应液稀释20倍，取0.5～2mL稀释的反应液到试管中，加入相同体积量的3，5-二硝基水杨酸溶液，沸水浴3～5min，在波长在520nm，测定各个溶液的吸光度，以酶活为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到函数方程；
(3)待测糖化液的制备：称取0.5～1.5g糖化酶样品，于500mL容量瓶中用pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲溶液稀释定容，于比管中加入20～30mL质量浓度为1.5～2.5％的淀粉溶液和3～8mL pH为4.6的乙酸-
乙酸钠缓冲液，40℃水浴预热5～10min；加入待测糖化酶溶液1.5～2.5mL，开始计时，反应25～35min，向比管中添加0.2～0.5mL质量浓度为20～25％的NaOH溶液，摇匀，迅速用水冷却，终止酶反应；
(4)空白液制备：于比管中加入20～30mL质量浓度为1.5～2.5％的淀粉溶液和3～8mL pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，40℃水浴预热5～10min；向比管中添加0.2～0.5mL质量浓度为20～25％的NaOH溶液，加入1.5～2.5mL待测糖化酶溶液，摇匀，迅速用水冷却；
(5)酶活力的测定：分别吸取5m L糖化液和5m L空白液，用蒸馏水稀释20倍定容至刻度，然后分别取0.05～1.5mL糖化液、空白液于两个试管中，各加相同体积量的3，5-二硝基水杨酸溶液，共同沸水浴3～5min，在520nm处比，记录吸光度；
(6)测出样品吸光度后，带入步骤(2)得到的函数方程得到对应的糖化酶活力。
200810141405.1权 利 要 求 书 第2/2页 2.根据权利要求1所述的用分光光度计测定糖化酶活力的方法，其特征在于：所用的3，5-二硝基水杨酸溶液的制备方法如下：
(1)甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2mL10％氢氧化钠中，并稀释至69mL，在此溶液中加入6.9g亚硫酸氢钠；
(2)乙液：称取255g酒石酸钠，加到300m L 10％氢氧化钠中，再加入880mL 1％3，5-二硝基水杨酸溶液；
(3)将甲液与乙液相混合即得黄试剂，贮于棕试剂瓶中，在室温下，放置7～10天以后使用。
200810141405.1说 明 书第1/13页
用分光光度计测定糖化酶活力的方法
技术领域
本发明属于生物化学分析领域，具体涉及一种用分光光度计测定糖化酶活力的方法。
背景技术
葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase EC3.2.1.3)又称γ-淀粉酶，简称糖化酶。主要存在于黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中，同时也存在于人的唾液、动物胰腺及细菌中。已报道的产糖化酶真菌微生物有23个属35个种，细菌有3属3种，用于工业生产的菌株主要是黑曲霉。糖化酶是一种外切型糖苷酶，从淀粉的非还原性末端依次水解a-1，4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，并像β-淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成β-D-葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a-1，
6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖.糖化酶也能微弱水解a-1，3连接的碳链，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖，因此被广泛地应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸、甘油、淀粉糖等工业中，是我国产量最大的酶制剂产品之一。但是，测定糖化酶活性的条件各不相同，我国大多采用终浓度1-1.6％可溶性淀粉为底物，加入酶液后于pH4.5-4.8，40-50℃反应一定时间，用次碘酸盐法测定还原糖含量，以每小时生成1m g葡萄糖所需的酶量，称为一个单位。美国M i l e s公司糖化酶DIAZYME采用4％淀粉为底物于pH值4.2，60℃反应1h用Schoorl法测定所生成葡萄糖的量，以1h生成1g还原糖作为1个单位(DU)。日本常用SP单位表示糖化酶活性，使用1.1％可溶性淀粉为底物，于pH4.8，55℃反应1h，用Lane-Eynon法定量还原糖，以每小时生成10mg葡萄糖所需酶量为1个单位。所有这些检测方法不仅速度慢，而且操作繁琐，对生产糖化酶过程中的在线测量十分不利，不能及时地指导生产。
发明内容
本发明的目的在于克服现有测定糖化酶活性方法中存在的测量速度慢，操作繁琐的缺点，提供一种测量速度快，操作方便的用分光光度计测定糖化酶活力的方法。
200810141405.1说 明 书 第2/13页 本发明目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的用分光光度计测定糖化酶活力的方法，它是按以下步骤进行的： (1)梯度样品的制作：称取
已知酶活的液体糖化酶，定容配制成浓度为0.0020～0.0030g/mL的糖化酶溶液，取至少5个比管，分别加入20～30mL质量浓度为1.5～2.5％的淀粉溶液和3～8mL pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，分别加入0～2mL的蒸馏水后摇匀40℃水浴预热5～10min；5个试管中蒸馏水的添加量呈梯度变化，向上述比管中分别加入不同稀释倍数的糖化酶溶液，开始计时，反应25～35min，分别向每个比管中添加0.2～0.5mL质量浓度为20～25％的NaOH溶液，摇匀，迅速用水冷却，终止酶反应；
(2)梯度样品吸光度的测定：分别吸取步骤(1)得到的反应液稀释20倍，取0.5～2mL稀释的反应液到试管中，加入相同体积量的3，5-二硝基水杨酸溶液，沸水浴3～5min，在波长在520nm，测定各个溶液的吸光度，以酶活为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到函数方程；
(3)待测糖化液的制备：称取0.5～1.5g糖化酶样品，于500m L容量瓶中用pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲溶液稀释定容，于比管中加入20～30mL质量浓度为1.5～2.5％的淀粉溶液和3～8mL pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，40℃水浴预热5～10min；加入待测糖化酶溶液1.5～2.5mL，开始计时，反应25～35min，向比管中添加0.2～0.5mL质量浓度为20～25％的NaOH溶液，摇匀，迅速用水冷却，终止酶反应；
(4)空白液制备：于比管中加入20～30mL质量浓度为1.5～2.5％的淀粉溶液和3～8mL pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，40℃水浴预热5～10min；向比管中添加0.2～.5质量浓度为20～25％的NaOH溶液，加入1.5～2.5mL待测糖化酶溶液，摇匀，迅速用水冷却；
(5)酶活力的测定：分别吸取5m L糖化液和5m L空白液，用蒸馏水稀释20倍定容至刻度，然后分别取005～1.5mL糖化液、空白液于两个试管中，各加相同体积量的3，5-二硝基水杨酸溶液，共同沸水浴3～5min，在520nm处比，记录吸光度；
(6)测出样品吸光度后，带入步骤(2)得到的函数方程得到对应的糖化酶活力。
所用的3，5-二硝基水杨酸溶液的制备方法如下：
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