(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710737536.5
(22)申请日 2017.08.24
(71)申请人 上海生物芯片有限公司
地址 201203 上海市浦东新区李冰路151号
(72)发明人 徐祎春 韩峻松 袁箐 周佳菁
(74)专利代理机构 上海浦一知识产权代理有限
公司 31211
代理人 陆红杰
(51)Int.Cl.
C12Q 1/68(2006.01)
C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种人BRAF基因V600E突变的
PCR检测方法，步骤包括：1)提取样本DNA并纯化；
2)以该DNA为模板，加入内参基因，用特异性检测
针，以及检测内参基因的引物对和探针，进行PCR
反应；3)判断样本BRAF基因V600E位点的突变状
态。本发明还公开了用于上述方法的特异性检测
人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对和探针
以及包含上述引物对和探针的试剂盒。本发明通
过设计特异性检测人BRAF基因V600E号位点的引
物对和探针，实现了V600E位点突变状态的快速、
准确、
灵敏检测。
权利要求书2页 说明书9页序列表2页 附图6页CN 107400716 A 2017.11.28
C N 107400716
A
1.人BRAF基因V600E突变的PCR检测方法，其特征在于，步骤包括：
1)提取样本DNA并纯化；
2)以步骤1)所得DNA为模板，加入内参基因以及检测该内参基因的引物对和探针，使用特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对和探针，进行PCR扩增反应；
所述检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对的上游引物具有与SEQ ID NO:1所示序列80％以上相同的序列，下游引物具有与SEQ ID NO:2所示序列80％以上相同的序列；
所述检测人BRAF基因V600E位点突变状态的探针具有与SEQ ID NO:3所示序列80％以上相同的序列；
3)判断样本BRAF基因V600E位点的突变状态。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示；所述上游引物的序列3’端的最后一个碱基上标记有锁核酸；所述检测人BRAF基因V600E位点突变状态的探针的序列如SEQ ID NO:3所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内参基因为人GAPDH基因，所述检测内参基因的引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO:4所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，探针的序列如SEQ ID NO:6所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR为荧光定量PCR；步骤1)纯化后的DNA浓度为0.6～20ng/μL；步骤2)检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物和探针的浓度为0.1～0.5μM；PCR反应条件为：92～97℃预变性0.5～10min；92～97℃变性10～30s，55～60℃退火10～60s，40～50个循环；步骤3)根据CT值判断样本BRAF基因V600E位点的突变状态。
5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR为数字PCR；步骤1)纯化后的DNA浓度为0.04～20ng/μL；步骤2)检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物的浓度为0.5～0.9μM，探针的浓度为0.1～0.5μM；PCR反应条件为：92～97℃预变性0.5～10min；92～97℃变性10～30s，56～60℃退火10～60s，40～50个循环；98℃灭活10min；步骤3)根据阳性拷贝数判断样本BRAF基因V600E位点的突变状态。
6.特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对，包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物具有与SEQ ID NO:1所示序列80％以上相同的序列；所述下游引物具有与SEQ ID NO:2所示序列80％以上相同的序列。
7.根据权利要求6所述的引物对，其特征在于，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示；所述下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示。
8.根据权利要求6所述的引物对，其特征在于，所述上游引物的序列3’端的最后一个碱基上标记有锁核酸。
9.特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的探针，其特征在于，所述探针具有与SEQ ID NO:3所示序列80％以上相同的序列。
10.根据权利要求9所述的探针，其特征在于，所述探针的序列如SEQ ID NO:3所示。
11.检测人BRAF基因V600E突变的PCR反应试剂盒，其特征在于，包含有权利要求6-8任一项所述的引物对，以及权利要求9或10所述的探针。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，还包含有内参基因，以及检测内参基
因的引物对和探针，所述检测内参基因的引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO:4所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，探针的序列如SEQ ID NO:6所示。
人BRAF基因V600E突变的PCR检测方法、引物、探针及试剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及生物检测领域，特别是涉及人BRAF基因V600E突变状态的检测。
背景技术
[0002]鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(v-raf murine sacoma viral oncogene homolog B1,BRAF)是迅速加速纤维肉瘤(rapidly Accelerated Fibrosarcoma，RAF)家族中的成员之一，是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路中鼠类肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS)下游的核心分子，是MEK/ERK激活途径中关键的激活因子，在调节细胞的生长、增殖和凋亡方面具有重要作用。
[0003]BRAF基因位于人染体7q34，包含18个外显子，编码蛋白质分子全长约94Kd。BRAF 主要有三个保守区，分别是CR1、CR2和CR3。其中CR3区为激酶的结构域，含甘氨酸环，是ATP 的结合位点和主要激活区域，而且这区域的两个位点T598和S601的磷酸化对激活BRAF蛋白起着至关重要的作用。几乎BRAF基因上所有的突变都处于激酶结构域，主要是第600位密码子产生突变，包括V600E、V600K、V600R、V600D、V600M和V600L等，另外还有1798_1799ins、1799_1801del等。其中，V600E占据所有突变的80％左右。BRAF基因V600E突变可致使BRAF蛋白结构中V600E的氨基酸突变，使BRAF激酶发生持续性活化，激活MAPK通路，导致癌变。[0004]BRAF基因突变与各种癌症相关，包括非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、恶性黑素瘤、甲状腺癌、非小细胞肺癌和肺腺癌等。在66％的恶性肿瘤中都存在BRAF基因的错义突变。其中恶性黑素瘤、结直肠癌、甲状腺癌中发现了较大比例的BRAF突变。黑素瘤中BRAF基因的突变率最高，约40％～68％转移性黑素瘤发生BRAF突变。另外5％～8％结肠癌也发生BRAF突变。BRAF在甲状腺癌中突变率约为5％～20％，其中，在甲状腺乳头状癌亚型中突变率最高，为30％～70％。
[0005]2011年，首个BRAF V600E靶向抑制剂维罗非尼(Vemurafenib，Zelboraf)被FDA批准上市，用于BRAF V600E突变的晚期黑素瘤患者，有效延长了患者无进展生存期及总生存期，取得了突破性的效果。2013年，FDA批准了达拉非尼(Dabrafenib，Tafinlar)用于转移性黑素瘤和不适合做手术的黑素瘤病人。达拉非尼是FDA继维罗非尼之后的第二个针对B R A F V600E突变的
靶向分子药物。同年，F D A批准曲美替尼(Trametinib，Mekinist)伴有BRAF V600E或V600K突变的不可切除或转移性黑素瘤。曲美替尼是一个靶向MEK1和MEK2(mitogen-activated protein kinase)的激酶抑制剂。2014年，美国FDA批准曲美替尼与达拉非尼联用晚期黑素瘤皮肤癌。此外，BRAF基因V600E突变的体还受益于多靶点药物索拉非尼(Sorafenib)和瑞格非尼(Regorafenib)。索拉非尼是一种针对CRAF和野生型以及V600E突变的BRAF的有效抑制剂。瑞格非尼是一种针对KIT、RET、RAF-1、BRAF等多靶点的激酶抑制剂。
[0006]目前普遍应用的BRAF基因V600E位点突变方法为TaqMan探针法和DNA直接测序等。TaqMan探针法是利用Taq酶3’>5’外切核酸酶活性，切断探针，释放荧光信号的方法。但是
TaqMan探针法存在成本高昂、前期预实验周期较长的缺点。DNA直接测序是基于双脱氧核糖核酸链末端终止的原理，获得DNA碱基序列。该方法的缺点：检测周期较长，花费昂贵，非闭管操作，难以避免交叉污染，通量不高。因此，以上两种方法都难适用于临床检测。而临床迫切需要开发一种快速、准确、操作简便和避免交叉污染的BRAF基因V600E位点突变检测技术，满足临床用药和检测诊断方面的时效性要求。
[0007]锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)是一种类寡核苷酸衍生物，结构中β-D-呋喃核糖的2'-O、4'-C位通过缩水作用形成刚性的结构。与传统DNA探针相比，LNA具有以下优点：(1)和DNA、RNA互补
的双链有很强的热稳定性(ΔTm＝3～8℃)，而同时遵守沃森-克里克(Watson-Crick)的碱基配对原则；(2)抗3′脱氧核苷酸酶降解的稳定性；(3)LNA-DNA杂交物能激活RNase H；(4)水溶性好，能自由穿入细胞膜，易被机体吸收；(5)体内无毒性作用；(6)高效的自动寡聚化作用，合成方法相对简单。
[0008]突变扩增系统(amplification refractory mutation system，ARMS)又称等位基因特异性扩增法(allele specific amplification，ASA)，基本原理是：如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。ARMS PCR具有以下优点：(1)实验周期短；(2)实验成本低；(3)灵敏性较高。
发明内容
[0009]本发明要解决的技术问题之一是提供一对特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对，它可以用于特异、灵敏地检测人BRAF基因V600E位点的突变状态。
[0010]为解决上述技术问题，所述特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对包括上游引物和下游引物，其中，上游引物具有与SEQ ID NO:1所示序列80％以上相同的序列，下游引物具有与SEQ ID NO:2所示序列80％以上相同的序列。
[0011]较佳的，所述上游引物的序列优选为SEQ ID NO:1所示的序列；所述下游引物的序列优选为SEQ ID NO:2所示的序列。
[0012]较佳的，可以在所述上游引物的序列3’端的最后一个碱基上标记锁核酸，以提高PCR反应的特异性。
[0013]本发明要解决的技术问题之二是提供一条特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的探针，所述探针具有与SEQ ID NO:3所示序列80％以上相同的序列。
[0014]较佳的，所述探针的序列优选为SEQ ID NO:3所示的序列。
[0015]本发明要解决的技术问题之三是提供一种检测人BRAF基因V600E突变的PCR反应试剂盒，该试剂盒包含有上述特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对和探针。[0016]所述试剂盒中还可以包含有内参基因，以及用于检测内参基因的引物对和探针。所述内参基因可以选择人GAPDH基因，也可以选择其他合适的基因作为内参。检测人GAPDH 内参基因的引物对包括上游引物和下游引物，其中，上游引物具有与SEQ ID NO:4所示序列80％以上相同的序列(优选SEQ ID NO:4所示序列)，下游引物具有与SEQ ID NO:5所示序列80％以上相同的序列(优选SEQ ID NO:5所示序列)。检测人GAPDH内参基因的探针具有与SEQ ID NO:6所示序列80％以上相同的序列(优选SEQ ID NO:6所示序列)。
[0017]进一步的，上述试剂盒中还可以包含有人BRAF基因V600E野生型和突变型的基因组DNA标准品，分别用作阴性对照和阳性对照。所述人BRAF基因V600E突变型基因组DNA标准
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