(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011268764.0
(22)申请日 2020.11.13
(71)申请人 中国农业大学
地址 100193 北京市海淀区圆明园西路2号
中国农业大学西校区园艺楼621室
(72)发明人 高俊平 孙小明 陈昶曦
(74)专利代理机构 北京格允知识产权代理有限
公司 11609
代理人 谭辉
(51)Int.Cl.
C12N 15/29(2006.01)
C07K 14/415(2006.01)
C12N 15/82(2006.01)
A01H 5/02(2018.01)
A01H 6/74(2018.01)
(54)发明名称
中的应用
(57)摘要
本发明涉及月季核因子RhNF ‑YC9及其在调
控花瓣扩展中的应用。具体地说，本发明涉及具
有如SEQ ID NO.2所示的开放阅读架序列的
RhNF ‑YC9基因或蛋白以及通过它们来调控花瓣 扩展的方法以及它们在调控花朵开放中的应用。
本发明揭示了RhNF ‑YC9转录因子在乙烯调控花
季鲜切花的花朵开放提供了新的思路和技术手
段，开辟了新的花朵调控研究领域，具有重大的
学术价值和重要的生产应用前景。权利要求书1页 说明书9页序列表3页 附图4页CN 112795572 A 2021.05.14
C N 112795572
A
1.RhNF ‑YC9基因，其特征在于，所述基因具有如SEQ ID NO.2所示的开放阅读架序列。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所述基因具有如SEQ ID NO.1所示的全长序列。
3.RhNF ‑YC9蛋白，其特征在于，所述蛋白由权利要求1或2所述的基因编码；优选的是，所述蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的序列。
4.一种调控花瓣扩展的方法，其特征在于，所述方法通过调节植物的如权利要求1或2所述的基因或权利要求3所述的蛋白的表达来实现。
5.权利要求1或2所述的基因或权利要求3所述的蛋白在如下方面的应用：
(1)调控植物花朵开放尤其是花朵开放初期的花瓣扩展；
(2)调控植物体内乙烯对花瓣扩展的影响；
(3)调控植物体内赤霉素含量对花瓣扩展和花瓣大小的影响；
(4)调控植物细胞壁降解和合成对花瓣扩展的影响；
(5)调控植物细胞膨胀度改变对花瓣扩展的影响；
(6)调控植物细胞骨架重建对花瓣扩展的影响；和/或
(7)调控植物的选自由水通道蛋白基因RhPIP1；1/2；1、纤维素合成酶基因RhCesA2/3，木葡聚糖内糖基转移酶基因RhXTH2/6/23/30、扩展蛋白基因RhEXPA1/8和微管相关基因RhTOR3/4组成的组中的任一个或多个基因对花瓣扩展的影响。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用为调控植物体内乙烯与赤霉素的之间的交互作用；进一步优选为调控植物体内赤霉素20氧化酶(GA20ox)和/或赤霉素2‑β‑双加氧酶(GA2ox)的作用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：
所述调控通过抑制RhNF ‑YC9基因或蛋白的表达来延缓花瓣扩展；或所述调控通过促进RhNF ‑YC9基因或蛋白的表达来促进花瓣扩展。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的应用，其特征在于：
通过至少部分地沉默RhNF ‑YC9基因来实现所述延缓，优选的是，选择RhNF ‑YC9基因的3’端来沉默RhNF ‑YC9基因；或通过过表达RhNF ‑YC9基因来实现所述促进。
9.根据权利要求5至9所述的应用，其特征在于，所述应用为使花瓣的下表皮细胞的尺寸下降和/或使单位面积内花瓣的下表皮细胞数量增加。
10.根据权利要求4所述的方法或权利要求5至9所述的应用，其特征在于，所述植物为蔷薇科植物或植物材料，更优选为月季或月季鲜切花。
权 利 要 求 书1/1页CN 112795572 A
月季核因子RhNF‑YC9及其在调控花瓣扩展中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及月季核因子RhNF‑YC9 及其在调控花瓣扩展中的应用。
背景技术
[0002]花朵是开花植物的一个必不可少的器官，花朵开放调控是植物生理研究尤其是以花朵作为观赏部位的观赏植物生理研究中的一个重要方面，而花朵能否成功开放以及能够充分开放主要依赖于花瓣扩展情况。
[0003]月季(Rosa hybrida)是世界上最重要的切花之一，具有很高的观赏价值和经济价值。在中国，约75％的切花月季产自云南省(数据来自农业农村部)。目前，长距离运输是全国供应切花月季的主要方
式，然而在运输过程中，乙烯(Ethylene)的产生严重影响了花朵的开放，而花朵开放的进程决定了切花月季的观赏时间。另外，由于我国幅员辽阔，而且切花月季进口和出口量大，使得从生产地将切花月季往消费地运输需要冷链远距离运输，影响了切花月季尤其是离开母体的月季切花的正常开放，经常发生“僵花”现象。因此，研究乙烯调节的花朵开放机理尤其是花瓣扩展机理，进而用于保持切花月季的观赏价值具有重要意义。
[0004]乙烯在植物生长发育过程中的多个方面发挥重要作用，主要包括种子萌发、器官伸长、开花、果实成熟、器官衰老和脱落。然而，乙烯调节的花朵开放尤其是花瓣扩展的分子机制仍有待进一步研究。
[0005]转录因子广泛参与植物激素信号通路调控植物生长发育。核因子 Y(NF‑Y)转录因子参与调控植物发育和逆境响应。NF‑Y蛋白通常由NF‑YA、NF‑YB和NF‑YC三个亚基组成，它们以三聚体的形式结合在一起，并形成稳定的复合物。在拟南芥中，NF‑YC亚家族有13 个成员，它们能够与其他转录因子互作形成各种特异复合体发挥作用。例如，NF‑YC4能够与Qua‑Quine Starch(QQS)互作调控植物的代谢， nf‑yc3/4/9三重突变体具有更短的下胚轴。然而，NF‑YC转录因子如何被乙烯调控及是否介导了花瓣扩展等生理活动仍不清楚。
发明内容
[0006]本发明人在月季花瓣中分离到一个NF‑YC转录因子RhNF‑YC9，研究发现RhNF‑YC9基因的表达在花朵开放初期被诱导，但其表达受乙烯抑制，进而发现RhNF‑YC9是在乙烯调节的花朵开放尤其是花瓣扩展中重要的调节因子。于是，本发明人研究了RhNF‑YC9调控花朵开放的作用机制，尤其是乙烯与其他植物激素之间的交互作用，鉴定了RhNF‑YC9调控的下游基因，从而完成了本发明。
[0007]于是，本发明在第一方面提供了RhNF‑YC9基因，所述基因具有如SEQ ID NO.2所示的开放阅读架序列。优选的是，所述基因具有如SEQ ID NO.1所示的全长序列。优选的是，所述基因可以采用如 SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物进行克隆。
[0008]本发明在第二方面提供了RhNF‑YC9蛋白，所述蛋白由本发明第一方面所述的基因
编码。优选的是，所述蛋白具有如SEQ ID NO.3 所示的序列。
[0009]本发明在第三方面提供了一种调控花瓣扩展的方法，其特征在于，所述方法通过调节植物的如权利要求1或2所述的基因或权利要求3 所述的蛋白的表达来实现。[0010]本发明在第四方面提供了本发明第一方面所述的基因或本发明第二方面所述的蛋白在如下方面的应用：
[0011](1)调控植物花朵开放尤其是花朵开放初期的花瓣扩展；
[0012](2)调控植物体内乙烯对花瓣扩展的影响；
[0013](3)调控植物体内赤霉素含量对花瓣扩展和花瓣大小的影响；
[0014](4)调控植物细胞壁降解和合成对花瓣扩展的影响；
[0015](5)调控植物细胞膨胀度改变对花瓣扩展的影响；
[0016](6)调控植物细胞骨架重建对花瓣扩展的影响；和/或
[0017](7)调控植物的选自由水通道蛋白基因RhPIP1；1/2；1、纤维素合成酶基因RhCesA2/3、木葡聚糖内糖基转移酶基因RhXTH2/6/23/30、扩展蛋白基因RhEXPA1/8和微管相关基因RhTOR3/4组成的组中的任一个或多个基因对花瓣扩展的影响。
[0018]优选的是，所述应用为调控植物体内乙烯与赤霉素之间的交互作用对花瓣扩展的影响；进一步优选为调控植物体内赤霉素20氧化酶 (GA20ox)和/或赤霉素2‑β‑双加氧酶(GA2ox)对花瓣扩展的影响。
[0019]另外优选的是，所述调控通过抑制RhNF‑YC9基因或蛋白的表达来延缓花瓣扩展；或所述调控通过促进RhNF‑YC9基因或蛋白的表达来促进花瓣扩展。
[0020]另外优选的是，通过至少部分地沉默RhNF‑YC9基因来实现所述延缓，优选的是，选择RhNF‑YC9基因的3’端来沉默RhNF‑YC9基因；或通过过表达RhNF‑YC9基因来实现所述促进。
[0021]另外优选的是，所述应用为使花瓣的下表皮细胞的尺寸下降和/ 或使单位面积内花瓣的下表皮细胞数量增加。
[0022]另外优选的是，所述植物为蔷薇科植物或植物材料，更优选为月季或月季鲜切花例如‘萨曼莎’(R.hybrida‘Samantha’)。
[0023]花朵开放快慢直接影响到观赏期。乙烯作为花瓣扩展的负调节因子，通过转录调节影响到花朵的开放进程。本发明人从月季花瓣中克隆了NF‑YC转录因子基因RhNF‑YC9，经研究发现RhNF‑YC9的表达在花朵开放初期被诱导，但其表达受到乙烯的抑制，RhNF‑YC9基因的沉默使花瓣从2级到5级的扩展速度减慢。在RhNF‑YC9沉默的花瓣中，与细胞壁松弛、细胞膨压和细胞骨架重塑相关的11个细胞扩展相关基因的表达显著下调。此外，本发明人经过研究发现，在 RhNF‑YC9沉默的花瓣中，赤霉素生物合成基因RhGA20ox的表达显著降低，而赤霉素分解代谢基因RhGA2ox的转录显著增加。进一步对活性GA含量的测定发现，RhNF‑
YC9沉默的花瓣中的GA
4和GA
7
的含量显著降低。另外，RhGA20ox和RhGA2ox的表达趋势与乙烯
处理结果一致。这些结果表明，RhNF‑YC9在花瓣开放过程中介导了乙烯和GA生物合成之间的交互作用。本发明人的研究结果揭示了NF‑YC转录因子在乙烯调控的花瓣扩展中的作用，为调控植物花朵开放尤其是月季鲜切花的花朵开放提供了新的思路和技术手段，开辟了新的花朵调控研究领域，具有重大的学术价值和重要的生产应用前景。
附图说明
[0024]图1显示了RhNF‑YC9在花朵开放阶段和不同激素处理下的表达。 RhNF‑YC9在月季花瓣不同开放时期(A)及乙烯、GA、6‑BA和NAA 处理下的表达模式(B)。以RhUBI2为内对照。所有数值均为5个生物重复的平均值±SD。图中展示经Student’s t‑test检验的结果，其中星号表示差异有统计学意义(**P<0.01)。
[0025]图2显示了RhNF‑YC9沉默影响花瓣的扩展。(A)采用qRT‑PCR 方法检测了RhNF‑YC9沉默植株(TRV‑RhNF‑YC9)和TRV对照植株中RhNF‑YC9的表达。(B)记录对照(TRV)和沉默植物 (TRV‑NF‑YC9)的开花表型，并在不同时间点拍照。(C)花朵从2 级到5级的开放天数。(D)记录花朵直径变化。以RhUBI2为内参。结果是至少5个生物重复的平均数±SD。图中展示经Student’s t‑test 检验的结果，其中星号表示差异有统计学意义(*P<0.05，**P<0.01)。[0026]图3显示了RhNF‑YC9沉默植株的花瓣大小
和花瓣下表皮细胞观察结果。(A)RhNF‑YC9沉默和TRV对照植株的花瓣大小。标尺： 1厘米。图像下方的数字表示花瓣面积(平均值±SD，n＝5)。(B) RhNF‑YC9沉默和TRV对照样本花瓣下表皮细胞密度。标尺：50μm。细胞计数单位为1024μm2。图像下面的数字表示单位面积内的细胞数量(平均值±SD，n＝5)。[0027]图4显示了RhNF‑YC9沉默对月季花瓣细胞扩展基因的影响。利用qRT‑PCR技术对RhNF‑YC9沉默的月季花瓣中的12个细胞扩展相关基因进行了分析。基因包括水通道蛋白基因(RhPIP1；1，RhPIP2；1)，纤维素合成酶基因(RhCesA2，RhCesA3)，木葡聚糖内糖基转移酶基因(RhXTH2，RhXTH6，RhXTH23，RhXTH30)，扩展蛋白基因(RhEXPA1， RhEXPA8)和微管相关基因(RhTOR3，RhTOR4)。以RhUBI2为内对照。结果显示为三个生物学重复的平均值±SD。图中展示经 Student’s t‑test检验的结果，其中星号表示差异有统计学意义(*P<0.05， **P <0.01)。
[0028]图5显示了RhNF‑YC9沉默对月季花瓣活性赤霉素的影响。 (A)采用qRT‑PCR方法检测了RhNF‑YC9沉默的月季花瓣中的RhGA20ox(GA生物合成基因)和RhGA2ox(GA分解代谢基因)的表达。(B)RhNF‑YC9沉默和TRV对照植株的花瓣中活性赤霉素含量。(C)采用qRT‑PCR方法检测了乙烯和对照处理的月季花瓣中RhGA20ox和RhGA2ox的表达。结果显示为三个生物重复的平均值±SD。图中展示经Student’s t‑test 检验的结果，其中星号表示差异有统计学意义(**P<0.01)。
[0029]图6显示了RhNF‑YC9参与月季花瓣扩展的示意图。根据本发明的研究结果，RhNF‑YC9的表达在花朵开放早期上调，但受到乙烯的抑制。RhNF‑YC9通过增加GA20ox和降低GA2ox 表达来促进赤
霉素的积累。GA可能通过诱导参与细胞壁松弛、细胞膨压调节和细胞骨架重塑的基因表达来增大细胞大小，并最终促进花瓣扩展。
具体实施方式
[0030]实施例
[0031] 1.材料及方法
[0032] 1.1植物材料和处理
[0033]月季‘萨曼莎’组培苗培养在含1.0mg/L 6‑苄基氨基嘌呤 (6‑BA)、0.05mg/Lα‑萘乙酸(NAA)和3mg/L赤霉素(GA3)的 MS培养基上，在22±1℃，长日照(光照16h/黑暗8h)。将四周龄的小苗移至含有0.1mg/L NAA的1/2MS培养基上生根。接下来，将生根幼苗移栽到蛭
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