(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011574278.1
(22)申请日 2020.12.25
(83)生物保藏信息
CCTCC NO: M 2020336 2020.07.21
(71)申请人 湖北工业大学
地址 430068 湖北省武汉市洪山区南李路
28号
(72)发明人 蔡俊 郭依依 王常高 杜馨
赵泽鑫
(74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001
代理人 江丽丽
(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)
C12N 9/80(2006.01)
C12P 19/26(2006.01)
C12R 1/01(2006.01)C12R 1/085(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种高产甲壳素脱乙酰酶的
菌剂组合，包括红球菌HQcdag （Rhodococcus
sp .)，保藏编号CCTCC NO:M 2020336，以及蜡状
芽孢杆菌CJPE209（Bacillus cereus ），保藏编号 CCTCC NO:M 2015734。相比红球菌单独发酵，这 两株菌通过协同发酵将甲壳素脱乙酰酶的酶活
提升了约14倍，
且显著缩短了发酵时间。权利要求书1页 说明书7页 附图5页CN 112553123 A 2021.03.26
C N 112553123
A
1.高产甲壳素脱乙酰酶的菌剂组合，其特征在于，包括红球菌HQcdag （Rhodococcus sp .)，保藏编号CCTCC NO: M 2020336，以及蜡状芽孢杆菌 CJPE209（Bacillus cereus ），保
藏编号CCTCC
NO: M 2015734。2.根据权利要求1所述的菌剂组合，其特征在于，蜡状芽胞杆菌CJPE209和红球菌HQcdag的活菌数比为1‑2：1‑4。
3.根据权利要求1或2所述的菌剂组合，其特征在于，蜡状芽胞杆菌CJPE209和红球菌HQcdag的活菌数比为1：4。
4.权利要求1至3中任一项所述的菌剂组合在生产甲壳素脱乙酰酶中的应用。
5.权利要求1至3中任一项所述的菌剂组合在降解甲壳素中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 112553123 A
高产甲壳素脱乙酰酶的菌剂组合及其应用
技术领域
[0001]本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种高产甲壳素脱乙酰酶的菌剂组合及其应用。
背景技术
[0002]甲壳素(C8H13O5N)n，又称几丁质，是存在于各类甲壳动物的外壳及真菌细胞壁中的一种难溶的N‑乙酰‑D‑葡萄糖胺聚合物。甲壳素脱乙酰率达到55％及以上即为壳聚糖，壳聚糖广泛应用于工业(布料、衣物、染料、纸张和水处理等)，农业(杀虫剂、植物抗病毒剂)，渔业(养鱼饲料、化妆品美容剂、毛发保护、保湿剂等)，医疗产业(隐形眼镜、人工皮肤、缝合线、人工透析膜和人工血管等)等领域，尤其在生物医学领域，由于其良好的生物相容性，在组织工程、创伤愈合、生物传感器方面有很好的应用前景。 [0003]壳聚糖的制备方法主要有化学法、物理法、发酵法和酶法等。应用最广泛的是化学法，在高温条件下，用强碱溶液浸泡甲壳素脱去乙酰基来制备壳聚糖。化学法制备壳聚糖耗碱量大、污染环境、得到的产品特性不稳定(乙酰度不均匀，分子量变化大，乙酰基所在位置不固定)；发酵法即利用发酵工
厂的废菌丝体来提取壳聚糖，此方法可综合利用工业废渣，但是所得产物杂质较多，分离纯化步骤较为复杂；物理法主要有微波法和超声波法，耗能高、脱乙酰效果差。酶法制备壳聚糖有望解决上述方法所存在的问题，具有良好的应用前景。
[0004]在甲壳素酶法脱乙酰制备壳聚糖的过程中，常用的酶有甲壳素酶、壳聚糖酶、甲壳素脱乙酰酶、几丁二糖酶等。从作用机制来看，甲壳素酶、壳聚糖酶和几丁二糖酶都具有切断糖链分子的作用，只有甲壳素脱乙酰酶是专一性的用于甲壳素脱去乙酰基的酶，它在脱乙酰的过程中，不会切断壳聚糖分子的的糖链。同属甲壳素酶系的其他酶对于甲壳素脱乙酰酶的协同作用尚未报道，但存在可能。
[0005]甲壳素脱乙酰酶(chitin deacetylase,E.C.3.5.41，以下简称CDA)可作用于甲壳素及甲壳素的相关衍生物，如甲壳寡糖、羧甲基甲壳素、甲壳素的脂肪族二元醇等，此外甲壳素脱乙酰酶还可作用于不同状态的甲壳素，如胶状甲壳素、粉状甲壳素、无定型甲壳素和晶态甲壳素等。研究发现，甲壳素脱乙酰酶的水解过程大致如下：首先，甲壳素脱乙酰酶随机结合到底物分子链的任一序列上，然后以结合部位的非还原端为起点，沿着该链脱去乙酰基，水解完毕后，与底物解离，然后结合到另一条底物分子链上，开始新一轮的水解。研究发现，作用的底物(分子链长度)对CDA脱乙酰的效果影响很大。Martinou等研究来源于Mucor rouxii的甲壳素脱乙酰酶作用于全水溶性部分N乙酰化壳聚糖时发现，底物为水溶性壳多聚糖(30单位聚体)时，底物的脱乙酰作用位点在三个或三个以上时才能被该酶水解。
当作用底物为甲壳寡糖(2～7单位聚体)时，甲壳素脱乙酰酶只对三个及以上的甲壳寡糖底物具有活性。
[0006]产甲壳素脱乙酰酶菌株大多为真菌，已在毛霉、根霉、被孢霉、犁头霉、酵母等十几个真菌中检测到，最早由Araki和Ito于1974年在鲁氏毛霉中发现；已知产该酶的细菌不多，
有短杆菌、红平红球菌、菌、枯草芽孢杆菌等。如Kauss等发现的Colletotrichum lindemuthianum菌株可将甲壳素脱乙酰酶分泌到细胞外，从培养液中直接提取，纯蛋白的比活最高达72U/ml；放线菌作为产甲壳素脱乙酰酶菌株，其自身产的抗生素可减少染菌机率，但也可能抑制酶活。王瑶等筛选出的放线菌桔橙小单孢菌可产庆大霉素、罗沙米星等多种抗菌抗生素，具有良好的脱乙酰效果。
[0007]产甲壳素脱乙酰酶菌株的选育主要有三种途径：1.人工筛选，SUN等从连云港土样中分离得到一株酶活高达238.89U/ml的红球菌；蔡俊等从实验室保藏的几十株真菌中确定了构巢曲霉和蓝犁头霉两种产酶能力最强的真菌。2.诱变育种，秦汪艳等以一株海洋来源的丝状真菌(Penicilium janthinellum)1‑5‑2为出发菌株，经紫外诱变后获得一株高产CDA菌株UV‑210S，酶活最高可达16.76U/ml。3.构建基因工程菌，Carole Gauthier等将来源于Rhizopus circinans的三种几丁质脱乙酰酶基因(RC,D2，和13/2)导入到毕赤酵母中表达，发现只有一种重组酶(RC)具有活性，推测可能是由于三种酶蛋白的分泌信号裂解位点不同(RC和I3/2处于较上游)，而该位点的错误选择导致后两种重组
酶的错误折叠。[0008]目前已报道的文献中，尚未见到协同发酵产甲壳素脱乙酰酶的相关文献。现有的关于甲壳素脱乙酰酶的专利文献主要集中在三个方面：1.使用酶法或微生物发酵法从虾蟹壳或昆虫皮壳等原材料中提取壳聚糖，如CN107653294A公开了一种从虾蟹废料中同时制取虾蟹青素、壳聚糖的方法，是利用枯草芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌协同作用加以葡萄糖来发酵虾蟹皮和虾蟹头进行脱盐和脱蛋白质，然后利用嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌共生体系发酵一周进行脱钙和脱，利用甲壳素脱乙酰酶处理甲壳素，用革兰氏阴性菌类志贺邻单胞菌处理得氨基葡萄糖。此法在发酵的过程中无需大量的酸碱加入，减少了环境污染，且实现了对废弃原料的再利用，经济可行。CN101078023B公开了一种从蚕蛹、蝇蛆的皮壳中制取甲壳素/壳聚糖的方法，包括以下步骤：将蚕蛹、蝇蛆的皮壳通过干法或湿法破碎细粉化处理；将得到的细粉体经来自微生物的脂肪酶粗酶液和蛋白酶粗酶液进行共酶解反应，充分脱除蛹皮/蛆皮原料中的脂肪和蛋白质；用两步法脱；收集脱后物料，洗涤、干燥后制成甲壳素产品；通过米根霉全细胞固定化生物反应器进行循环脱乙酰反应，得到壳聚糖；用产酸细菌进行液体深层发酵壳聚糖获得高度水溶性的甲壳寡糖。该法利用固定化细胞循环脱乙酰，大幅提高了产品质量和生产效率。2.甲壳素脱乙酰酶菌株的筛选及应用，CN101608177A以虾壳培养土为筛选原材料，用抗真菌药抑制真菌的生长，依次采用平板涂布、平板划线等方法进行纯化，同时用N‑对硝基乙酰苯胺(PN)‑酪蛋白平板进行CDA活性验证，分离得到能分泌CDA的蜡样芽胞杆菌，并通过液体发酵制备CDA，发酵液上清的CDA 活力为0.598‑0.912U/ml，该菌株适合于大规模工业发酵，无需加工改造即可应用。此外，产甲壳素脱乙酰酶的其他真菌及细菌的专利文献也有报道。
3.甲壳素脱乙酰酶的制备，C N102676485A公开了一种制备甲壳素脱乙酰酶的方法，该方法用短柄梨孢帚霉(Scopulariopsisbrevicaulis)作甲壳素脱乙酰酶产生菌，经活化后将其接入到含有发酵培养基的发酵容器中，使其在pH值为6.5‑7.0之间，温度在27‑29℃、转速200‑240rpm的摇床上发酵90‑100小时，发酵液经分离、盐析、纯化得甲壳素脱乙酰酶产品，此方法制备的甲壳素脱乙酰酶每ml发酵液的活力单位最高可达36U。CN101659960A则公开了一种总状毛霉来源甲壳素脱乙酰酶的生物制备方法，包括下列步骤：(a)制备含基因序列如SEQ ID NO.1所述甲壳素脱乙酰酶的重组表达载体；(b)制备含有步骤(a)所述重组表达载体的转化体；(c)
表达和纯化甲壳素脱乙酰酶。此发明设计基因特异性简并引物，采用逆转录‑聚合酶链式反应和快速扩增cDNA片段末端技术，结合重组DNA的方法，利用已有的原核表达载体，得到了能够产生甲壳素脱乙酰酶的大肠杆菌菌株，为生物法制备甲壳素脱乙酰酶提供了可靠的来源，且大大缩短了生产周期，降低了提取成本，得到高产和高质量的产品酶。
发明内容
[0009]由于自然选育的产甲壳素脱乙酰酶菌株产酶量低，多为胞内酶，不易分离纯化，且不易作用于天然甲壳素，因此本发明一方面筛选出一株产甲壳素脱乙酰酶的红球菌HQcdag (Rhodococcus sp.)，另一方面发现该菌株与蜡状芽孢杆菌CJPE209(Bacillus cereus)协同发酵可显著提高甲壳素脱乙酰酶的酶活，通过协同发酵方法不仅能高产甲壳素脱乙酰酶，且大大缩短了发酵时间。
[0010]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0011]高产甲壳素脱乙酰酶的菌剂组合，包括红球菌HQcdag(Rhodococcus sp.)，保藏编号CCTCC NO:M 2020336，以及蜡状芽孢杆菌CJPE209(Bacillus cereus)，保藏编号CCTCC NO:M 2015734。
[0012]进一步地，为了提高甲壳素脱乙酰酶的酶活，蜡状芽胞杆菌CJPE209和红球菌HQcdag的活菌数比为1～2：1～4；最优的，蜡状芽胞杆菌CJPE209和红球菌HQcdag的活菌数比为1：4。
[0013]上述菌剂组合在生产甲壳素脱乙酰酶或降解甲壳素中的应用。在本发明的具体实施例中，优化了红球菌HQcdag和蜡状芽孢杆菌CJPE209协同发酵的最优条件(摇瓶培养)，具体为：发酵时间24h，温度35℃，总接种量3％，转速160r/min，装液量50ml(摇瓶为250ml)，培
养基成分为：酵母浸粉2.5g/L、蛋白胨2.5g/L、胶体甲壳素5g/L、NaCl 5g/L、K
2HPO
4
1g/L、
KH
2PO
4
1g/L、MgSO
4
0.5g/L，该条件下甲壳素脱乙酰酶的酶活为421.4U/ml。
[0014]与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
[0015]自然选育的产甲壳素脱乙酰酶菌株所产酶多为胞内酶，酶活不高，且对具有致密晶体结构的天然甲壳素降解慢，发酵周期长。本发明采用双菌株协同发酵产甲壳素脱乙酰酶的方法，使酶活由红球菌HQcdag单独发酵的16.37U/mL增加到226.27U/mL，且发酵时间从大多数文献中报道的72h缩短到24h。
附图说明
[0016]图1为红球菌HQcdag(Rhodococcus sp.)的生长曲线。
[0017]图2为蜡状芽孢杆菌CJPE209(Bacillus cereus)的生长曲线。
[0018]图3为蜡状芽孢杆菌CJPE209和红球菌HQcdag种子液配比优化结果。
[0019]图4为发酵周期对甲壳素脱乙酰酶酶活的影响。
[0020]图5为总接种量对甲壳素脱乙酰酶酶活的影响。
[0021]图6为发酵转速对甲壳素脱乙酰酶酶活的影响。
[0022]图7为装液量对甲壳素脱乙酰酶酶活的影响。
[0023]图8为发酵温度对甲壳素脱乙酰酶酶活的影响。
[0024]图9为寡糖标样的HPLC图。
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