(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201410588581.5
(22)申请日 2014.10.28
A61K 35/413(2015.01)
A61P 27/02(2006.01)
A61P 1/16(2006.01)
A61P 29/00(2006.01)
(71)申请人上海凯宝药业股份有限公司
地址201401 上海市奉贤区工业综合开发区
程普路88号
(72)发明人王伯初 谭君 祝连彩 季庆治
娄德帅 徐英 张小利
(74)专利代理机构上海申新律师事务所 31272
代理人刘懿
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种人工熊胆粉及其制备方
法，所述制备方法包括如下步骤：a)将禽畜胆粉
渣和滤液；b)将所述滤液加入装有7α-羟基类固
醇脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶和辅酶I 或辅
酶II 的反应器中进行反应；
c)将反应完毕后的反应液冷冻干燥后与所述滤渣混合，得到人工熊胆
工熊胆制备的原料，不需要再添加其他化学物质，
且采用常见动物胆汁，其胆源易采、易得、易加工；
通过体外模拟肝肠循环过程，把禽畜胆汁生物转
化为与天然熊胆粉化学等值的人工熊胆粉，作为
天然熊胆替代品，保护濒危动物亚洲黑熊，促进熊
胆产业健康发展。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书8页(10)申请公布号CN 104382941 A (43)申请公布日2015.03.04
C N 104382941
A
1.一种人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)将禽畜胆粉用pH＝7～9的缓冲液溶解后进行过滤，得到滤渣和滤液；
b)将所述滤液加入装有7α-羟基类固醇脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶和辅酶I或辅酶II的反应器中进行反应；
c)将反应完毕后的反应液冷冻干燥后与所述滤渣混合，得到人工熊胆粉。
2.如权利要求1所述的人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中的缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
3.如权利要求1所述的人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，所述步骤a)包括如下过程：所述禽畜胆粉用pH＝7～9的缓冲液溶解后，11000g条件下离心10min后，多次过滤，得到滤渣和滤液，所述滤渣冷冻干燥保存。
4.如权利要求1所述的人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，所述步骤b)包括如下过程：所述滤液加入装有7α-羟基类固醇脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶和辅酶I或辅酶II 的反应器里室温反应2～6h。
5.如权利要求1所述的人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，所述步骤c)包括如下过程：将反应完毕后的反应液冷冻干燥48h后与所述滤渣混合均匀，得到人工熊胆粉。
6.如权利要求1所述的人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，所述禽畜胆粉为鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉、牛胆粉、兔胆粉、狗胆粉、羊胆粉中的一种或多种混合物。
7.如权利要求1或6所述的人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，所述禽畜胆粉的主要成分和质量百分比如下：
总胆酸：40～65％
氨基酸：4～9％
微量元素：0.5～1％
其中，所述总胆酸中含有TCDCA，所述TCDCA占禽畜胆粉的质量百分比为40～50％。
8.如权利要求1所述的人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，所述7α-羟基类固醇脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶为和辅酶I或辅酶II在反应器中以固定化的方式存在。
9.如权利要求8所述的人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，所述步骤b)包括如下酶固定化步骤：在1％的壳聚糖溶液中加入适量醋酸，制得壳聚糖醋酸溶液，将所述壳聚糖醋酸溶液注入到三聚磷酸钠溶液中固化，得到壳聚糖球；将所述壳聚糖球放入盛有0.125％戊二醛水溶液的容器中活化，得到活化壳聚糖微球；称取预定量的所述活化壳聚糖微球，装入层析柱，加入适量的7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶液，采用垂直混合方式使之与微球结合，得到固定化酶。
10.如权利要求9所述的人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，在所述含有固定化酶的反应器中加入所述步骤a)中的滤液作为反应底物溶液，加入预定量辅酶I或辅酶II，使辅酶I或辅酶II:TCDCA＝1:2～1:4(摩尔比)，在20～30℃下，反应2～6h。
11.如权利要求1所述的人工熊胆粉的制备方法，其特征在于，所述7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶来源于撒丁岛梭菌、脆弱拟杆菌或产气柯林斯菌。
12.一种人工熊胆粉，其特征在于，由权利要求1-11任一项权利要求所述的制备方法制取。
13.如权利要求12所述的人工熊胆粉，其特征在于，所述人工熊胆粉的主要成分和质
量百分含量如下：
总胆酸：40～65％
氨基酸：4～9％
微量元素：0.5～1％；
其中，所述总胆酸含有TUDCA和TCDCA，所述TUDCA占人工熊胆粉的质量百分比为23～33％；所述TCDCA占人工熊胆粉的质量百分比为12～30％。
14.如权利要求13所述的人工熊胆粉，其特征在于，所述TUDCA和TCDCA的质量比为1～1.5。
一种人工熊胆粉及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于药物领域，特别涉及一种人工熊胆粉及其制备方法。
背景技术
[0002] 熊胆，由熊科动物黑熊或棕熊干燥胆囊胆汁得到，具有清热、平肝、明目的功效，其主要成分是牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)。熊胆是四大名贵动物药之一，有2000余年的入药历史，有大量的处方都含有熊胆成分。我国每年熊胆粉产量约30吨，仍然满足不了人类健康的需求。目前高端熊胆粉供需矛盾的日益突出和低端原料用熊胆粉市场需求的持续增加，使得熊胆粉的价格节节攀升，市场价格已经超过了5000元/kg。更为严峻的是，国内外动物保护组织对活熊取胆的长期抵制，特别是最近的“归真堂”事件再次引起了国际国内社会的广泛关注，给国内熊胆粉的生产和相关产业的发展带来了前所未有的阻力。
[0003] 因此，加快人工熊胆的研发，促进熊胆产业可持续发展已经提上了议事日程。但与同属珍稀动物用药的麝香和牛黄不同，迄今为止，我国的“人工熊胆”尚未获得国家药监局的新药批准。
[0004] 根据目前检索的专利文献，涉及人工熊胆的制备方法主要包括以下几方面：[0005] (1)中国专利CN201010039550.6(人工熊胆粉的合成新技术)中，公开了以来源广泛，价格低廉的禽胆为基础原料，经物理方法分离去除蛋白质、多糖、脂类杂质成分，保留与天然熊胆粉相似的活性成分，再添加一定量熊胆特有的牛磺熊去氧胆酸、氨基酸、微量元素等。
[0006] (2)中国专利CN03133771.6(人工熊胆)中，公开了以牛黄熊去氧胆酸钠、鸡胆膏、胆红素为原料制备的人工熊胆。
[0007] (3)中国专利CN01112258.7(人造熊胆粉的制备方法)，用禽胆汁在强氧化剂和还原剂的作用下，将胆汁中的牛磺鹅去氧胆酸转化成牛磺熊去氧胆酸，然后添加胆汁素、胆汁酸成分，加工配制成人造熊胆粉。
[0008] (4)中国专利CN02134299.7(人工熊胆及其制造方法)，将牛磺熊去氧胆酸钠、混合胆素、多种氨基酸、矿质元素、米糠油、胆固醇、卵磷脂等混合通过一定工艺，制成人工熊胆。
[0009] (5)中国专利CN200910172589.2(人工熊胆)，利用兔胆、鸡胆、鸭胆、鹅胆混合而成制成人工熊胆。但牛磺熊去氧胆酸含量达不到药典标准。
[0010] (6)中国专利CN201210162695.4(人工熊胆)，将禽胆汁中的一种或几种的混合物、和牛胆汁、
羊胆汁、兔胆汁、狗胆汁中的一种或几种的混合物与化学合成的牛磺熊去氧胆酸混合而制成人工熊胆。
[0011] (7)中国专利CN201310027917.6(一种人工熊胆粉及其制备方法)，以禽胆为原料，加入牛黄熊去氧胆酸钠制备而成。
[0012] 目前技术制备出的人工熊胆仍然存在问题，有的技术仅仅将不同禽畜胆汁混合在一起而制成的产品的牛磺熊去氧胆酸的含量根本无法达到药典的标准。很多技术是在禽畜
胆汁混合物的基础上添加了一些化学物质比如牛磺熊去氧胆酸、胆素、氨基酸等以使制成品的化学成分与天然熊胆粉的成分相似，但无法真正成为熊胆替代品。
[0013] 所以为了克服现有人工熊胆制备技术缺陷，有必要提出一种新的人工熊胆制备方法，在不添加其他化学成分的前提下，将禽畜胆汁体外模拟生物催化转化，并通过一定工艺制成人工熊胆，使其成分与天然熊胆化学等值。
发明内容
[0014] 本发明所要解决的技术问题是提供一种人工熊胆粉及其制备方法，将禽畜胆粉通过体外模拟生物催化转化制取人工熊胆粉，使其成分与天然熊胆化学等值。
[0015] 本发明为解决上述技术问题而采用的技术方案是提供一种人工熊胆粉的制备方法，包括如下步骤：a)将禽畜胆粉用pH＝7～9的缓冲液溶解后进行过滤，得到滤渣和滤液；b)将所述滤液加入装有7α-羟基类固醇脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶和辅酶I或辅酶II的反应器中进行反应；c)将反应完毕后的反应液冷冻干燥后与所述滤渣混合，得到人工熊胆粉。
[0016] 上述的人工熊胆粉的制备方法，其中，所述步骤a)中的缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
[0017] 上述的人工熊胆粉的制备方法，其中，所述步骤a)包括如下过程：所述禽畜胆粉用pH＝7～9的缓冲液溶解后，在11000g条件下离心10min后，一次或多次过滤，得到滤渣和滤液，所述滤渣冷冻干燥保存。
[0018] 上述的人工熊胆粉的制备方法，其中，所述步骤b)包括如下过程：所述滤液加入装有7α-羟基类固醇脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶和辅酶I或辅酶II的反应器里室温反应2～8h。
[0019] 上述的人工熊胆粉的制备方法，其中，所述步骤c)包括如下过程：将反应完毕后的反应液冷冻干燥48h后与所述滤渣混合均匀，得到人工熊胆粉。
[0020] 上述的人工熊胆粉的制备方法，其中，所述禽畜胆粉为鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉、牛胆粉、兔胆粉、狗胆粉、羊胆粉中的一种或多种混合物。
[0021] 上述的人工熊胆粉的制备方法，其中，所述禽畜胆粉的主要成分和质量百分比如下：
[0022] 总胆酸：40～65％
[0023] 氨基酸：4～9％
[0024] 微量元素：0.5～1％；
[0025] 其中，所述总胆酸中含有TCDCA，所述TCDCA占禽畜胆粉的质量百分比为40～50％。
[0026] 上述的人工熊胆粉的制备方法，其中，所述7α-羟基类固醇脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶在反应器中以固定化的方式存在。
[0027] 上述的人工熊胆粉的制备方法，其中，所述步骤b)包括如下酶固定化步骤：在1％的壳聚糖溶液中加入适量醋酸，制得壳聚糖醋酸溶液，将所述壳聚糖醋酸溶液注入到三聚磷酸钠溶液中固化，得到壳聚糖球；将所述壳聚糖球放入盛有0.125％戊二醛水溶液的容器中活化，得到活化壳聚糖微球；称取预定量的所述活化壳聚糖微球，装入层析柱，加入适
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