(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510600365.2
(22)申请日 2015.09.21
(71)申请人 上海复旦张江生物医药股份有限公
司
地址 201210 上海市浦东新区张江园区蔡
伦路308号
(72)发明人 唐海玲 张金平 毛文学 苏勇
(74)专利代理机构 上海容慧专利代理事务所
(普通合伙) 31287
代理人 王裕
(51)Int.Cl.
G01N 33/15(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种脂质体药物的测试方法，尤
其涉及一种在体外模拟脂质体药物进入体内后
的释药过程的测试方法。本发明通过将脂质体药
或旋转等运动模拟体内血液循环对药物的动力
作用，使得体系中的空气在运动中分散形成气
泡，与脂质体发生物理碰撞，从而破坏脂膜，达到
药物的有效释放。所有操作参数，包括温度、转
速、容器内脂质体药物与空气的体积比等均为可
控，便于调节释放速率，可在短时间内实现药物
的游离药物，
起到模拟体内漏槽状态的效果。权利要求书1页 说明书11页 附图3页CN 106546705 A 2017.03.29
C N 106546705
A
1.一种脂质体药物体外释放的测试方法，所述脂质体药物为溶液形态，该方法包含如下步骤：
(1)在预定的温度下，将所述脂质体药物与空气按照预设的体积比装入容器内，并将所述容器封闭；
(2)令所述容器进行在竖直方向上存在来回位移的运动；
(3)在所需时间点取样，并测定所述脂质体药物中的未释放药物浓度或已释放的药物浓度，计算药物的释放速率。
2.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于所述预定的温度为30～60℃。
3.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于所述脂质体药物与空气的体积比为1:(0.1～5)。
4.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于所述步骤(2)中的所述运动为绕一非竖直的旋转轴旋转，且所述容器为条状，所述容器以径向垂直所述旋转轴的方式安装。
5.如权利要求4所述的测试方法，其特征在于所述旋转运动利用分子杂交仪完成，所述旋转轴为水平，所述容器为离心管，所述转速为15～50rpm。
6.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于在所述步骤(1)中，向所述容器内加入预设量的用于吸附释放出的游离药物的离子交换树脂，所述的预设量不小于将所述脂质体药物内包封的所有药物全部吸附所需的量。
7.如权利要求6所述的测试方法，其特征在于所述离子交换树脂为阳离子交换树脂。
8.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于所述脂质体药物为脂质体蒽环类药物、脂质体长春新碱或脂质体两性霉素B。
9.如权利要求8所述的测试方法，其特征在于所述蒽环类药物为柔红霉素、阿霉素、阿柔比星、表阿霉素、伊达比星、戊柔比星或米托蒽醌。
10.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于所述脂质体药物为脂质体阿霉素。
一种脂质体药物体外释放的测试方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种脂质体药物的测试方法，尤其涉及一种在体外模拟脂质体药物进入体内后的释药过程的测试方法。
背景技术
[0002] 自20世纪90年代磷脂双层膜发现以来，脂质体作为药物递送载体的研究获得了长足发展。脂质体是指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体。磷脂分子在水中将分子亲水头部插入水中，疏水尾部伸向空气，形成具有脂质双层结构的球形脂质体，粒径通常为25～1000nm。
[0003] 脂质体的双层膜结构类似于生物膜，具有良好的生物相容性；经脂质体包裹的药物，具有靶向性、长效性、低毒性以及包封保护良好的优点。因此，脂质体被用于多种活物的递送，以改善药物进入体内后的血液循环时间，增加在靶部位的蓄积。通过改变粒子的粒径、脂质处方组成以及脂膜表面特征，可以改变脂质体的功能。使用不同脂质材料可以制备长循环脂质体、热敏脂质体、pH敏感脂质体、免疫脂质体等各种功能性脂质体，达到特殊目的。
[0004] 因此，为了合理设计脂质体药物递送系统，就需要对药物在体内和体外的释放行为进行详细研究，通过体外模拟脂质体药物进入体内后的释药过程进行测试。
[0005] 然而，目前仅有的测试方法都有严重不足之处。以阿霉素脂质体为例，FDA指南中的体外释放考察方法仅仅给出了介质pH和温度这两个实验参数，通过大体积缓冲液或含有人血浆的缓冲液模拟体内生理环境。但由于阿霉素在脂质体内以硫酸阿霉素的沉淀形态存在，溶解度很低，导致释放速率太慢，难以满足质量控制体系中快速评估的要求。[0006] Avi Schroeder和Yechezkel Barenholz采用的低频超声法(LFUS)能在短时间(3分钟)内释放80％的药物，但低频超声会导致脂质膜瞬态孔样缺陷，对脂质体的破坏剧烈，释放中的脂质体已无制剂概念，无法模拟体内生理环境。Atsuko Hioki和Yoshie Maitani 采用在高温(50℃)条件下，加入牛血清白蛋白(bovine serum albumin(BSA))来加速药物释放；Koji Nakamura和Hiroaki Kasukawa利用在经pH梯度法制备的脂质体中加入不同浓度铵离子的方法评估药物释放行为，并区分加载了药物的脂质体的不同脂质组分。上述方法虽然能在较短时间内完成释放，但其释放曲线十分不稳定，重复性差，无法作为质量评价的标准。
[0007] Jennifer A.Shabbits和Lawrence D.Mayer研究了的多层囊泡“沉淀”过量100倍环境下的大单层囊泡(large unilamellar vesicles，LUVs～100nm)的药物释放速率，以模拟血细胞和组织中的大膜池。该方法虽然能获得脂质体药物在体内滞留的真实属性，但由于MLVs的多变性，仍难以实现精确地质量评估。
[0008] 综上可以看出，现有的脂质体药物体外释放测试方法难以在药物释放速率与体内体外相关性及可重复性之间获得平衡。
[0009] 本发明的目的在于提供一种脂质体药物体外释放的测试方法，其能高度模拟体内药物释放的生理环境、各操作参数可控、能大大提高释药速率、重复性高。
[0010] 为实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：
[0011] 一种脂质体药物体外释放的测试方法，所述脂质体药物为溶液形态，该方法包含如下步骤：
[0012] (1)在预定的温度下，将所述脂质体药物与空气按照预设的体积比装入容器内，并将所述容器封闭；
[0013] (2)令所述容器进行在竖直方向上存在来回位移的运动；
[0014] (3)在所需时间点取样，并测定所述脂质体药物中的未释放药物浓度或已释放的药物浓度，计算药物的释放速率。
[0015] 进一步地，所述脂质体药物为脂质体蒽环类药物、脂质体长春新碱或脂质体两性霉素B，优选为脂质体阿霉素。
[0016] 进一步地，所述步骤(2)中的所述运动为绕一非竖直的旋转轴旋转，且所述容器为条状，所述容器以径向垂直所述旋转轴的方式安装。
[0017] 更进一步地，所述步骤(2)的旋转运动利用分子杂交仪完成，所述旋转轴为水平，所述容器为离心管，所述转速为15～50rpm。
[0018] 进一步地，所述步骤(1)中，所述体积比为1:(0.1～5)；所述预定的温度为30～60摄氏度。
[0019] 进一步地，所述步骤(1)中，所述脂质体药物与空气按照预设的体积比可定义为所述容器内还存在不少于其容积25％的空气。
[0020] 进一步地，在所述步骤(1)中，向所述容器内加入预设量的用于吸附释放出的游离药物的离子交换树脂，所述的预设量不小于将所述脂质体药物内包封的所有药物全部吸附所需的量；所述步骤(3)中测定的是所述脂质体药物中的未释放药物浓度。
[0021] 更进一步地，当所述脂质体药物内包封的药物选自蒽环类药物、长春新碱或两性霉素B；所述离子交换树脂为阳离子交换树脂。
[0022] 与现有方法相比，本发明具有如下优点：
[0023] (1)通过容器运动模拟体内血液循环对药物的动力作用，能更好地模拟药物进入体内后的释放行为，其释放过程更接近体内释放的真实情况；
[0024] (2)所有操作参数，包括温度、转速、容器内脂质体药物与空气的体积比等均为可控，从而能方便地调节释放速率，可在短时间内实现药物的有效释放；
[0025] (3)释放过程可随时暂停，不影响重启后的药物释放，便于取样；
[0026] (3)实验重复性远高于现有技术的各种方法；
[0027] (4)若在容器内加入离子交换树脂，则可利用树脂对释放出来的游离药物进行即时吸附，起到模拟体内漏槽状态的效果，并能快速测定残留的未释放药物浓度，大大提高实验效率。
[0028] 综上所述，本发明在药物释放速率与体内体外相关性及可重复性之间获得了平衡，是一种能综合满足体外释放实验各方面需求的方法。
[0029] 图1：实施例1～3中，不同温度下的药物释放曲线；
[0030] 图2：实施例4、2、5中，不同药物体积下的药物释放曲线。
[0031] 图3：实施例6～8中，不同药物体积下的药物释放曲线。
[0032] 图4：实施例2、9、10中，不同转速下的药物释放曲线。
[0033] 图5：实施例11～14中，不同阳离子吸附树脂加入量下的药物释放曲线。[0034] 图6：本发明重复性试验：不同样品在不同时间点的阿霉素释放速率。
具体实施方式
[0035] 本发明的基本原理是通过容器运动模拟体内血液循环对药物的动力作用，体系中的空气在运动中分散，形成气泡与脂质体发生物理碰撞，从而破坏脂膜，达到药物的有效释放。
[0036] 在实验温度方面，选择磷脂相变温度52度附近为宜，优选40～50摄氏度。虽然温度越高脂膜的流动性越好，药物释放速率越快，但过高的温度会破坏脂质体本身，也就谈不上释放。因为该方法下药物的释放速度不仅能通过温度调节，还可通过转速或空气占比来调节，所以除非是专门针对温度梯度进行试验，可以选择30度或更低、60度或更高，否则无需选择过于极端的温度。
[0037] 容器的运动必须具备竖直方向上的位移，否则无法使浮在溶液上方的空气与溶液中脂质体发生相对碰撞。为达到混合效果，最简单的运动方式就是上下震荡或旋转。实际操作中，则利用分子杂交仪进行绕水平轴的旋转最为方便，且离心管需以径向垂直旋转轴的方式竖直设置在旋转轴四周。这样的旋转方式使得空气的分散效果更好，对体内血液循环的模拟更真实。
[0038] 同时，还可利用离子交换树脂对释放出来的游离药物进行吸附，释放出的游离药物被交换树脂吸附，就能方便地直接测定残留药物浓度。
[0039] 阳离子树脂可吸附蒽环类药物(柔红霉素、阿霉素、阿柔比星、表阿霉素、伊达比星、戊柔比星、米托蒽醌)、长春新碱、两性霉素B等，其中强酸型阳离子交换树脂具有强酸性的反应基如磺酸基(-SO
3
H)，可以广泛吸附所有的阳离子；弱酸型阳离子交换树脂具有较
弱的反应基如羧基(-COOH基)，仅可交换弱碱中的阳离子如Ca
2+、Mg
2
+。阴离子交换树脂主
要是强碱型阴离子交换树脂，可以和所有阴离子进行交换吸附。
[0040] 若在实验开始前先加入离子交换树脂，则可起到模拟体内漏槽状态的效果；若在实验完成并取样后再加入离子交换树脂，则仅起到吸附游离药物，简化样品检测前处理操作用。
[0041] 以下通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。实施例考察了以下5个参数：离心管类型、温度、转速、药物溶液与空气体积比以及离子交换树脂加入量，对药物的释放速率的影响。
[0042] 实施例1：5ml离心管-温度37℃、转速25rpm、药物体积2ml-10％树脂[0043] (1)、配置脂质体阿霉素溶液：
[0044] 将pH 6.0的磷酸盐缓冲生理盐水(Phosphate buffered saline，PBS)放于超声清洗机中超声20min除气；用移液移取脂质体阿霉素1.25ml至50ml容量瓶中，用上述
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议