(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711294177.7
(22)申请日 2017.12.08
(71)申请人 吴斌
地址 116000 辽宁省大连市中山区长江东
路60号
申请人 江苏奇天基因生物科技有限公司
(72)发明人 吴斌 苏立明 张琳 马嗣同
郭利川 王智宏 应清界
(74)专利代理机构 大连东方专利代理有限责任
公司 21212
代理人 刘慧娟 李馨
(51)Int.Cl.
C12Q 1/689(2018.01)
C12Q 1/6844(2018.01)
C12Q 1/04(2006.01)
C12N 15/11(2006.01)G01N 21/64(2006.01)C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明公开一种检测布鲁氏杆菌RAA荧光法
检测试剂盒，检测试剂盒包括以下组分：RAA基础
荧光通用反应试剂、反应缓冲液、探针与引物混
合物、阴性质控品、阳性质控品及临界阳性质控
品。所述探针为5’端序列/荧光报告基团//
idSp//淬灭基团/3’端序列；本试剂盒可直接对
布鲁氏杆菌DNA检测，尤其可用于检测布鲁氏杆
菌DNA含量较低的样品；本试剂盒在30－42℃下
进行等温扩增检测，5－20min完成检测。试剂盒
操作简单，配合小型仪器、携带方便，具有快速、
灵敏、准确、重复性好的优点；适合基层和现场检
测，
具的良好的应用前景。
权利要求书1页 说明书9页序列表2页 附图2页CN 108048584 A 2018.05.18
C N 108048584
A
1.RAA荧光法检测布鲁氏杆菌的探针，其特征在于，
所述探针为5’端序列/荧光报告基团//idSp//淬灭基团/3’端序列；其中：
所述5’端序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述3’端序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述idSp为1个碱基空位；
所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5中的任一种；
所述淬灭基团选自TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL中的任一种。
2.一种布鲁氏杆菌RAA荧光法检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的探针以及下述引物：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求2所述的布鲁氏杆菌RAA荧光法检测试剂盒，其特征在于，所述的探针终浓度为0.02-0.05mM，所述上游引物及下游引物终浓度为0.05-0.1mM。
4.根据权利要求2所述的布鲁氏杆菌RAA荧光法检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括试剂RAA基础荧光通用反应试剂和反应缓冲液。
5.根据权利要求4所述的布鲁氏杆菌RAA荧光法检测试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液包括：使用浓度为450mM的Tris -HCl Buffer；260mM的MgAc；20％W/V的PEG 10000。
6.根据权利要求2所述的布鲁氏杆菌RAA荧光法检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如下试剂：阴性质控品、阳性质控品和/或临界阳性质控品；
所述阳性质控品含为布鲁氏杆菌的基因组DNA片段，使用浓度为1.0×104IU/mL；
所述临界阳性质控品为含布鲁氏杆菌的基因组DNA片段，使用浓度为1.0×103IU/mL；所述阴性质控品为不含有布鲁氏杆菌的基因组片段的试剂。
权 利 要 求 书1/1页CN 108048584 A
RAA荧光法检测布鲁氏杆菌的探针及试剂盒
[0001]本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种检测布鲁氏杆菌RAA荧光法检测的探 针、引物和试剂盒。
背景技术
[0002]布鲁氏杆菌病(brucellosis)简称布病，亦称“地中海热”、“马耳他热”、“波伏热”等，是 由一种布鲁氏杆菌(Brucella)感染牛、羊、猪等家畜，通过呼吸道、消化道、皮肤及生殖系 统等引起的人畜共患高度传染病。
[0003]布鲁氏杆菌是一种革兰氏阴性菌，其特点是不运动，几乎无荚膜(光滑型有微荚膜)，嗜 氧菌，氧化酶、触酶阳性，可还原硝酸盐，细胞内寄生，能在家畜体内存活。它一共包括六 种：牛型布鲁氏杆菌(流产布鲁氏杆菌)、羊型布鲁氏杆菌(马耳他布鲁氏杆菌)、猪布鲁氏 杆菌、狗布鲁氏杆菌、林鼠布鲁氏杆菌和绵羊布鲁氏杆菌等。布病主要发病于中东，非洲， 拉丁美洲，中亚和地中海周边几个地区，全球布鲁氏杆菌病患者已达50万左右，其疫情日趋 严重，从牧区、半牧区传播至农区甚至向城市蔓延的趋势。本菌侵入人体后，随淋巴液到达 淋巴结，被吞噬细胞吞噬，如布菌未被吞噬细胞杀灭，则细菌在胞内生长繁殖，形成局部原 发病灶。此阶段有人称为淋巴源性迁徙阶段，相当于潜伏期，潜伏期为7-60天，平均两周， 少数患者可达数月或1年以上。细菌在吞噬细胞内大量繁殖导致吞噬细胞破裂，随之大量细 菌进入淋巴液和血循环形成菌血症。在血液里细菌又被血流中的吞噬细胞吞噬，并随血流带 至全身，在肝、脾、淋巴结、骨髓等处的单核—吞噬细胞系统内繁殖，形成多发性病灶，造 成临床上不仅有菌血症、败血症，而且还有毒血症的表现。经一定时期后，感染灶的细菌生 长繁殖再次入血，导致疾病复发。组织病理损伤广泛。临床表现也就多样化。如此反复成为 慢性感染，慢性期多侵及脊柱和大关节，表现为长期发热(包括低热)、多汗、关节痛兼或肝、 脾、淋巴结和睾丸肿大等
可疑症状及体征。上个世纪我国经历两次大流行后疫情开始有了下 降趋势，但本世纪初，疫情又有回升势头。到2007年初，已有25个省市自治区发现人间和 畜间布鲁氏杆菌病。据统计我国受布鲁氏杆菌感染潜在风险的人数达3.5亿，每年新发病例 数约3万人。布病是我国近年来发病人数增长迅速的传染病之一。目前《中华人民共和国传 染病防治法》已经把布鲁氏杆菌病归类为乙类传染病，与我们更为熟悉的“非典”、“猪流感”、 “”、“艾滋病”、“狂犬病”、“乙肝”等同属一类传染病。
[0004]美国疾病控制中心(center for disease control，CDC)因此也认为它可以制成生化武器， 并将其定义为“B类生物恐怖主义药剂”。由此可见布病具有巨大潜在威胁人们的身体健康， 它是一个严重的公共卫生问题，并引发严重的经济损失和较高的全球健康负担，预防布病传 播成为我国和全球共同使命。
[0005]目前，布鲁氏杆菌的传统检测技术主要包括病原分离技术、培养特性鉴定技术、血清学 检测技术、免疫学学检测技术及分子生物学等技术。
[0006]布鲁氏杆菌病病原学检测是从感染的血液或组织中分离培养布鲁氏杆菌，利用固体培养基 如血清葡萄糖琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂培养基进行培养，检测原理是通过布鲁氏
杆菌的菌体 形态、染特征、菌落形态、生长特性、生化反应特点以及布鲁氏杆菌多克隆抗体凝集试验 等方法进行鉴别。此方法法是布鲁氏杆菌病诊断的“金标准”，其成本较低，具有定性和定量 分析特 点。但同时存在分离率比较低、容易污染、耗时较长等问题，且分离布鲁氏杆菌对环 境和工作人员存在生物安全风险，因而限制了该方法的使用。
[0007]血清检查是医学上常用的一种检测手段，包括各种凝集反应、补体结合反应、沉淀反应 等。
[0008]试管凝集反应(SAT)是一种经典的血清学凝集反应，它是指颗粒性抗原例如红细胞、细菌 等与相应的抗体在适量的电解质存在的条件下，经一定时间后凝聚成肉眼可见的凝集物。SAT 是我国布病检测的法定实验，其优势是SAT检测血清免疫球蛋白M(IgM)敏感性较高，操作 简便，判定容易，具有较高的诊断价值，但单独使用时特异性较差，且不能区分人工免疫和 自然感染。而且部分感染动物的抗体滴度达不到诊断水平，因而也易造成误诊和漏诊。
[0009]平板凝集试验(PAT)1939年Huddleson首先进行了平板凝集试验，因其检测速度较快， 在20世纪初，PAT是畜间检疫和人中流行病学快速初筛的一种简易的检测方法。所用抗原 是将高浓菌液置于高浓盐水中，用结晶紫和孔雀绿染料染菌体而制成，与SAT实验相比敏 感性较高，且特异性较高，但也可出现非特异性凝集。
[0010]虎红平板凝集试验是专门用来诊断布鲁氏杆菌病，它是pH 3.8±0.2高浓菌液，经标准血清 标化并用虎红染料(四氯四碘荧光素钠盐)染菌体而成。它主要特点是活化IgG，此法具有 特异性达97.1％和敏感性高达96％，并能去掉血清中非特异性凝集素，结果可靠，方法简便易 行，成本低廉，尤其适
用于布病的大面积检疫及流行病学调查。但不能鉴别人工免疫和自然 感染。
[0011]沉淀反应主要用于抗原或者抗体的定性检测。其原理是指可溶性抗原与相应抗体在有电 解质存在的情况下，按适当比例所形成的可见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀实验主要包 括絮状沉淀试验，环状沉淀试验和凝胶内的沉淀试验。
[0012]补体结合试验(CFT)：自1909年建立补体结合试验技术以来，得到了广泛应用。其原 理是补体能与任何抗原抗体复合物结合，但不能同单独的抗原或抗体结合。试验需两个系统(待检系统和指示系统)及补体，CFT法被认为是目前血清学试验中最为准确的技术之一， 并得到广泛应用。文献Nielsen K.Diagnosis of brucellosis by serology.[J] .Veterinary Microbiology,2002,90(1–4):447-459.报导认为CFT需大量不同试剂、大量各种各样对照组，每 次试验需要大量的滴定法，结论也具有主观性，而且不能鉴别人工免疫和自然感染，实验条 件复杂苛刻，鉴于这些缺点，CFT法不利于向基层推广，不宜在现场进行。
[0013]近年来，运用于布鲁氏杆菌菌临床检测的免疫学方法主要有：虎红平板凝集试验(RBPT)、 试管凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)、乳环试验(MRT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和胶体 金免疫层析法(GICA)等。免疫学方法简单易行，但敏感度低，特异性不高。[0014]分子生物学方法具有灵敏度高、特异性强等优点，主要的技术有聚合酶链式反应(简称PCR) 和环介导等温扩增技术。
[0015]聚合酶链式反应(简称PCR)创立于1985年，目前已成为病原微生物检测的常规技术，具有特 异性强、灵敏度高、简便、快速、对标本的纯度要求较低等特点，在PCR方法的基
础上，一些新的 分子生物学方法随之被运用于布鲁氏杆菌的检测中来。文献Hekmatimoghaddam S,Sadeh M, Khalili M B,et al.Comparison of PCR,Wright agglutination test and blood culture for diagnosis of brucellosis in suspected patients[J].Pakistan Journal of Biological Sciences Pjbs,2013, 16 (22):1589比较了PCR、试管凝集和血培养3种检测方法灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性 预测值，PCR比血培养的效能高，其检验结果与试管凝集一致。专利“201610617030.6布鲁氏菌 的检测方法、试剂盒及其应用”报导，采用PCR法，用离心柱法从血清标本中获取布鲁氏菌 DNA，获得待测样本；PCR扩增反应；采用荧光定量PCR仪检测反应结果，荧光信号收集时 设定为Taqman荧光探针BKV-FP 5’端荧光基团对应的荧光素，在60℃收集荧光信号，最低检 出可达到1000copies/mL；这种方法灵敏、特异、检出率高，但该方法对仪器要求及人员的专 业素养要求高，且需要一定的硬件支持，检测时间1.5－2小时，对提取的DNA纯度要求高。[0016]环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由日本学者 Notomi T等人针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)作用下，60-65℃恒温扩增，15-60分钟其扩增效率可达到109～1010个数量级。Liu Q等报道了使用6条特异性引物检测布鲁氏菌病的LAMP方法。此方法设计设计复杂，假阳 性出现高。
[0017]结合以上分析布鲁氏菌传统的检测方法有较为普遍的病原学检测技术，虽然成本低，但 同时具有检测率低、耗时和需要专业技术员操作等不足；免疫学方法具有灵敏度低、在感染 初期不易检测出来，存在漏检问题，不便于推广的原因在于实验过程需要动物实验，实验周 期长、成本高、操作繁琐；分子生物学检测技术可以满足敏感、特异性的检测需求，但目前 技术如PCR技术需要使用复杂的仪器、装备精良的实验室和专业的操作人员，LAMP技术虽 然不需要昂贵的PCR仪，但需设计多对引物且对靶基因序列要求很高，且假阳性出现高等缺 点。
发明内容
[0018]为了解决现有技术检测方法中费时费力、时间周期长且效率低、需要专业人员及昂贵仪 器，假阳性率高等问题，本发明实施例提供了一种用于检测布鲁氏杆菌核酸的引物、荧光探 针和试剂盒。本发明的试剂盒及检测方法采用RAA技术，克服了以上的缺点，具有检测时间 短、灵敏度高、特异性强、操作简单等特点。只需在39℃下反应5～20分钟便可分析结果。 具有快速、灵敏、操作简便等特点，对未来预防布鲁氏菌病传播具有非常重要的意义，具有 较大的应用前景。所述技术方案如下：
[0019]首先，本发明公开一种RAA荧光法检测布鲁氏杆菌的探针，所述探针为：
[0020]5’端序列/荧光报告基团//idSp//淬灭基团/3’端序列；其中：
[0021]所述5’端序列的核苷酸序列如S E Q I D N O.1所示，其序列信息为 CTTTATGATGGCAAGGGCAAGGTGGAAGAT；
[0022]所述3’端序列的核苷酸序列如S E Q I D N O.2所示，其序列信息为 TGCGCCTTCTGGCGAC。
[0023]因此，整个探针序列也可以表示为：5’-CTTTATGATGGCAAGGGCAAGGTGGAAGAT/ 荧光报告基团//idSp//淬灭基团/TGCGCCTTCTGGCGAC-3’。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议