免疫组化技术一、实验目的
了解并掌握水提醇沉法提取香菇多糖的原理和方法。
二、实验原理
提取香菇多糖的方法有：水提醇沉法（热水浸提法）、碱浸提法和酶解法。水提醇沉法是最常见的方法。香菇多糖溶于水。热水浸提时，香菇的组织细胞破裂，多糖成分浸出，再用乙醇沉淀香菇多糖。 光和影的传说料液比、温度、时间、PH值、乙醇浓度、提取次数都是影响提取效果的重要因素。最佳提取条件为：料液比1:40（30~40倍均可），提取温度为80~95℃，提取时间2h，提取时的乙醇浓度为75%，PH值6.0~8.0，提取次数为2次。三、材料和仪器
材料：香菇（取子实体）、蒸馏水、无水乙醇、Sevage试剂、
（Sevage试剂配制：取和正丁醇，按照5﹕1进行混合，放置在棕瓶中备用。）
仪器：分析天平、高速离心机、离心试管、冷冻干燥机、磁力搅拌器、恒温水浴锅、烧杯等。
四、实验步骤
1、提取：
将干燥的香菇子实体粉碎后，加入30倍的蒸馏水，用沸水提取2h，过滤，滤渣再按第一次提取工艺提取1次，将上清液合并后于80℃下浓缩。在冷却后的浓缩液中加入一定量95%的乙醇，使乙醇的浓度为75%，室温下放置过夜，离心，将收集到的沉淀用真空冷冻干燥机冻干，放到后4℃冰箱中保存、备用。2、sevage法除蛋白：
长宽比
信息披露称取得到的样品10g（含水率9.7%）充分溶解于100mL蒸馏水中。加入一定体积的Sevage试剂，用磁力搅拌器剧烈搅拌20 min 左右，离心，分离粗多糖中蛋白质杂质。重复2次。
3、乙醇沉淀：
往除过蛋白的多糖溶液（上清液）中缓慢加入95%的乙醇，至乙醇体积占溶液总体积的75%，边加边搅拌，使多糖均匀沉淀。放在4℃冰箱中6h，6000r/min 离心10min，弃去上清液，将沉淀在溶解于蒸馏水中，重复以上过程3次，将最后得到的溶液放在-40℃的冷冻干燥机中冻干，制得香菇粗多糖。 五、含量测定（苯酚-硫酸法）
1、标准曲线的绘制
波导
118114号码百事通精确称取100 mg 葡萄糖，溶解定容于100 mL容量瓶中，得含1 mg/mL葡萄糖的对照品储备溶液，备用。精确移取对照品储备液0.00，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00，3.50 mL，分别置于100 mL容量瓶中，蒸馏水稀释至刻度，制成不同浓度的标准溶液。然后从各瓶中分别移取2.0 mL标准液置于25 mL有塞比管中，加入6%苯酚溶液1.0 mL，摇匀后快速加入浓硫酸5.0 mL，于40℃水浴中显40 min，冷却至室温后，以第1瓶溶液为参比溶液，用分光光度仪在490 nm波长处测定吸光度。以浓度对吸光度作图，绘制标准曲线，并计算回归方程。
2、多糖提取率的测定
精确移取提取滤液1.00 mL于100 mL容量瓶中，蒸馏水稀释至刻度，作为供试液，样品供试液用苯酚-硫酸法的显方法测定吸光度，平行测定3次，根据线性回归方程计算样品中多糖的含量。多糖提取率（%）=（多糖质量/提取前香菇粉质量）×100%
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