【实验原理】
植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红化合物，在10－100mg范围内其颜深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜稳定160min以上。
【实验仪器及试剂】
1．仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。
2．试剂：
（1）90％苯酚溶液：称取90g苯酚（AR），加蒸馏水10mL溶解，在室温下可保存数月。 （2）9％苯酚溶液：取3mL 90％苯酚溶液，加蒸馏水至30mL，现配现用。
（3）浓硫酸（比重1.84）。
（4）1％蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。 （5）100ug/L蔗糖标准液：精确吸取1％蔗糖标准液1mL加入100mL容量瓶中，加水定容。
【实验步骤】
1．标准曲线的制作： 取20mL刻度试管11支，从0－10br715分别编号，按表27－1加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入1mL 9％苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以 5－20s。加入5 mL浓硫酸，摇匀。比液总体积为8 mL，在恒温下放置30min。显。然后以空白为参比，在485nm波长下比测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。
2．可溶性糖的提取 取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10－0.30g，共3份，分别放入3支刻度试管中，加入5-10mL 蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min
（提取2次），提取液过滤入25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。
3．测定吸取0.5mL样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算测试样品中糖含量。
式中：C一标准方程求得糖量（ug）
α一吸取样品液体积（mL）
V－提取液量（mL）
n一稀释倍数
W一组织重量（g）
可溶性糖含量（％）＝从标准曲线查得糖的量（μg）×提取液体积（ml）×稀释倍数/[测定用样品液的体积(ml)×样品重量(g)×106]×100
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1、方法原理
粗多糖在硫酸的作用下，水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚
缩合成有化合物，用分光光度法测定样品在粗多糖含量。
2、主要设备和仪器
设备721型分光光度计（上海第三分析仪器厂）
试剂
葡萄糖标准液：精确称取105℃干燥恒重的标准葡萄糖0.1000g，置100mL容量瓶中加热蒸馏水溶解稀释至刻度，其浓度为1.0mg/mL，用稀释成浓度为0.1mg/mLd的标准工作液。
5%苯酚溶液：取苯酚100g，沙浴蒸馏，收集180℃-182℃溜分，称取此馏分5g，用水溶解后，定容至100mL棕容量瓶中备用（现用现配）。
3、测定步骤
3.1、最大吸收波长的选择
精密吸取0.04mg/mL无水葡萄糖溶1.0 mL，置10mL具塞试管中，加入蒸馏水使体积为2.0mL，再加苯酚试液1.0mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0mL，摇匀后放置5min，置沸水浴中加热15min，取出后冷却至室温。以蒸馏水代替糖溶液如加上法配制空白。用721分光光度计在470-510nm测定吸光度，测定最大吸收波长为490±nm。
3.2、标准曲线的绘制
精密吸收浓度为0.1mg/mL的葡萄糖标准标准工作液0、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mL，分别置于10mL具塞试管中，各加蒸馏水使体积为2.0mL，再加苯酚试液1.0mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0 mL，摇匀后放置5min，置沸水浴中加热15min，取出后冷却至室温。以蒸馏水代替糖溶液如上法配制空白。用721分光光度计，1cm比皿，在490nm处测定吸光度，绘制葡萄糖浓度-吸光度工作曲线。结果浓度在0.010-0.04mg/mL范围内与吸光度呈现性关系。
回归方程Y=7.52×10-3X+1.13×10-3, Y=0.9997(n=6)。
3.3、含量测定
3.31、多糖的提取与精制 取300mL，用氟仿多次萃取，以除去蛋白质，加活性炭1%脱，抽滤，滤液加入95%乙醇，使含醇量达80%，静置过夜。过滤，残渣用无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤，真空干燥，即得粗多糖。
3.32、供试液的配制 精密称取粗多糖粉末0.2000g，置于50mL容量瓶中，定容，摇匀，即得供试品溶液。
3.33、样品含量测定 精密度吸取供试品溶液2.0mL，按“标准曲线绘制”项下方法分别测定吸光度。
结果计算：
多糖含量（%）=（C·D）/V×100
式中：
C－供试液葡萄糖浓度（mg/mL）；
D－代试液的稀释因素；
V－供试液体积（mL）。 |
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粗多糖测定方法的研究
摘要:应用硫酸-苯酚比法测食品中的粗多糖的含量而且分别用葡萄糖做标准品和用葡聚糖做标准品。结果表明前者测的结果稍偏高,大约高于4.8﹪。此方法简便快捷,准确度高,重现性好,可适用于各种粗多糖的测定。
关健词:枸杞多糖；灵芝多糖；分光光度法；
由十个以上单糖通过糖苷键连接而成的碳水化合物称为“多糖”。它一般都是天然高分子化合物。多糖包括活性多糖和膳食纤维两大类。活性多糖专指具有某种特殊生物活性的多糖化合物，如真菌多糖、植物多糖和壳聚糖等。这些多糖具有复杂的、多方面的生理活性和功能，如：免疫调节功能；抗肿瘤作用；延缓衰老作用；降血脂、抗血栓作用等功能[1-2]，因而越来越引起人们的关注。
多糖的测定方法目前还没有国家规定的方法,文献报道的方法基本上是苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，在作标准曲线大部分都是用葡萄糖来做标准品，而不是用葡聚糖（MW500，000），因为葡聚糖标准品在国内难于获得且价格昂贵。但是根据国内外大量研究资料表
明：香菇、金针菇、云芝、冬草、夏草、灵芝、茯苓、猪苓中所含的具有增强免疫、抑制肿瘤、镇静、强心、消炎等生理活性的水溶性多糖均由β(1—3)或β(1—6)糖苷键连接葡聚糖构成主链和支链，有的甚至就是β-葡聚糖，那么用葡萄糖作标准品和用葡聚糖作标准品去测食品中的多糖含量时是否有差别且差别为多少，本文以枸杞多糖和灵芝多糖来进行上述实验。
1.材料与方法
1.1供试材料
枸杞多糖 由深圳思味特科技有限公司提供(多糖含量在40-60﹪,其含量由国家检测部门检测)；
灵芝多糖 由深圳思味特科技有限公司提供(多糖含量在40-60﹪,其含量由国家检测部门检测)；
葡聚糖（MW500，000） sigma公司；
1.2试剂
（1）铜储备液：
称取0.3gCuSO45H2O,3g柠檬酸钠，加水溶解并稀释至100ml，混匀，备用。
（2）铜试剂溶液：
取铜储备液50ml，加水50ml，混匀后加入固体无水硫酸钠12.5g并使其溶解。临用新配。
（3）洗涤剂：
取水50ml,加入10ml铜试剂溶液，10ml氢氧化钠溶液，混匀。
（4）乙醇溶液(80﹪)：20ml水中加入无水乙醇80ml，混匀。
（5）氢氧化钠溶液(10﹪)：
称取lOg大阅兵2013氢氧化钠，加水溶解并稀释至100ml，加入固体无水硫酸钠至饱和，备用。
（6）硫酸溶液：
取10ml浓硫酸加入到80ml左右水中，混匀，冷却后稀释至文史哲100ml。
（7）苯酚溶液（5﹪）：
取苯酚100g，油浴蒸馏，收集180℃-182℃馏分。称取精制苯酚5.0g，加入溶解并稀释至100ml，混匀，溶液置冰箱中可保存一个月。
（8）葡萄糖/葡聚糖标准储备溶液：
精密称取在1050C于燥至恒重的葡萄糖/葡聚糖标准品1.0080g，加水溶解，并定容至100ml，
混匀，置冰箱中保存。此溶液每ml含10.080mg葡萄糖/葡聚糖。
（9）葡萄糖/葡聚糖标准使用溶液：
吸取葡萄糖/葡聚糖标准储备溶液2.00ml，置于100ml容量瓶中，加水至刻度，混匀，置冰箱中保存。
1.3仪器
752C紫外分光光度计
离心机
旋转混匀器
1.4实验方法
1.4.1 葡萄糖标准曲线制备
精密吸取葡萄糖标准使用溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，（相当于葡萄糖0，0.04032，0.08064，0.12096，0.16128，0.2016mg）分别置于25ml比管中，准确补充水至2.0ml，加入苯酚溶液2.0ml，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10ml，于旋转混
匀器小心混匀，置沸水浴中煮沸15min，冷却后用分光光度计在490nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比皿测定吸光度值。具体结果见表1。
表1 葡萄糖标准与浓度的关系
__________________________________________________________________
标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
浓度(mg/ml) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
吸光度(A) 0 0.166 0.343 0.514 0.690 0.882
___________________________________________________________________
以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘标准曲线（图1）。
图1 标准回归曲线方程图
其回归方程Y=4.4122X-0.0147,相关系数r=0.9996。
1.4.2 葡聚糖标准曲线制备
精密吸取葡聚糖标准使用溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，（相当于葡聚糖0，0.02，0.0
4，0.06，0.08，0.10mg）分别置于25ml比管中，准确补充水至2.0ml，加入苯酚溶液2.0ml，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10ml，于旋转混匀器小心混匀，置沸水浴中煮沸15min，冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比皿测定吸光度值。具体结果见表2。香港将承认内地婚姻家庭案件判决
表2 葡聚糖标准与浓度的关系
______________________________________________________________________
标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
浓度(mg/ml) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1
吸光度(A) 0 0.083 0.171 0.256 0.352 0.456
__________________________________________________________________
以葡聚糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线(见图2)。
图2 标准回归曲线方程图
其回归方程Y=4.635X-0.0145,相关系数r=0.9983。
mibk
1.5样品的测定
1.5.1样品提取
称取混合均匀的含粗多糖样品(M)2.0g,置于100ml(V1)容量瓶中,加水80ml左右,于沸水浴上加热2h,冷却至室温后补加水至刻度,混匀,过滤,滤液供沉淀多糖。
1.5.2沉淀粗多糖
精密取1.5.1项下滤液4.0ml(V2)(作四组平行实验)或液体样品(V2)4.0ml(即被测多糖就是液体而不是固体样品)置于50ml离心管中,加入无水乙醇16ml,混匀后,以4000rpm离心15min,弃去上清液。沉淀用乙醇溶液数毫升洗涤,离心后弃去上清液,反复3-4次操作。接下来沉淀用水溶解并定容至5.0ml(V3),混匀后,供沉淀葡聚糖。
1.5.3沉淀葡聚糖
精密取1.5.2项溶液2ml(V4)置于20ml离心管中,加入NaOH溶液2.0ml,铜试剂溶液2.0ml,沸水浴中煮沸3min,冷却后以4000rpm离心15min,弃去上清液。沉淀用洗涤剂数毫升洗涤,离心后弃去上清液,反复3次操作后,沉淀用硫酸溶液2.0ml溶解并转移至50ml(V5)容量瓶中，加水稀薄至刻度，混匀。此溶液为样品测定液。
1.5.4 测定
精密取1.5.3项的样品测定液2.0ml(V6)置于25ml比管中，加入苯酚溶液2.0ml,在旋转混合器上混匀后,小心加入浓硫酸10.0ml后于旋转混合器上混匀后,置于水浴中煮沸10min,冷却至室温用分光光度计在490nm波长处,以试剂空白为参比,1cm比皿测定吸光度值，同时做样品空白实验。从葡萄糖/葡聚糖标准曲线上查出葡萄糖/葡聚糖质量,再计算样品中粗多糖含量(见表3)。
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