(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011491802.9
(22)申请日 2020.12.16
(71)申请人 山东大学
地址 266237 山东省青岛市即墨滨海路72
号
(72)发明人 董学前 杨春玉 李珊楠
(74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限
公司 37221
代理人 宋海海
(51)Int.Cl.
C12N 9/02(2006.01)
C12N 15/53(2006.01)
(54)发明名称
备方法和应用
(57)摘要
本发明提供一种耐高温耐酸的超氧化物歧
品和食品技术领域。本发明从温泉环境来源的脂
环酸芽孢杆菌中克隆的一个SOD基因，并重组进
行外源表达，对其酶学特性进行了深入分析，发
特性，可用于生物医药、食品及化妆品等领域，因
此具有良好的实际应用之价值。
权利要求书2页 说明书9页序列表2页 附图3页CN 112522221 A 2021.03.19 C N 112522221
A
1.一种耐高温耐酸的超氧化物歧化酶，其特征在于，所述超氧化物歧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种超氧化物歧化酶类似物，其特征在于，其具有与权利要求1所述超氧化物歧化酶相同的生物活性，所述超氧化物歧化酶类似物是指在用所述超氧化物歧化酶和另一种化合物融合或者用所述超氧化物歧化酶的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白质而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白质。
3.一种超氧化物歧化酶衍生物，其特征在于，其氨基酸序列具有与权利要求1所述超氧化物歧化酶氨基酸主序列≥70％的一致性，≥90％的相似性，该衍生物是指把所述氨基酸的序列中的氨基酸的一个或者几个氨基酸的某个基团用另外的基团取代后与所述超氧化物歧化酶具有同样生物活性的超氧化物歧化酶。
4.一种超氧化物歧化酶变体，其特征在于，其氨基酸序列具有与权利要求1所述超氧化物歧化酶氨基酸主序列≥70％的一致性，≥90％的相似性，该变体是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列，所述改变包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中间的任一位置缺失、插入或替换氨基酸或核苷酸，或在序列两端添加氨基酸或核苷酸，所述超氧化物歧化酶变体具有与所述超氧化物歧化酶相同的生物活性。 5.编码权利要求1所述超氧化物歧化酶、权利要求2所述超氧化物歧化酶类似物、权利要求3所述超氧化物歧化酶衍生物或权利要求4所述超氧化物歧化酶变体的核苷酸。
6.如权利要求5所述核苷酸，其特征在于，其包含下组中的任一种：
(a)编码具有所述氨基酸序列的多肽或类似物、衍生物或其变体的核苷酸；
(b)与(a)所述核苷酸互补的核苷酸；
(c)与(a)或(b)中所述核苷酸有≥75％一致性的核苷酸；
优选的，所述a)中，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.权利要求1所述超氧化物歧化酶、权利要求2所述超氧化物歧化酶类似物、权利要求3所述超氧化物歧
化酶衍生物或权利要求4所述超氧化物歧化酶变体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括通过基因重组由基因工程菌生产而得。
8.如权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述方法至少包括：
合成编码所述超氧化物歧化酶、超氧化物歧化酶类似物、超氧化物歧化酶衍生物或超氧化物歧化酶变体的核苷酸；
将核苷酸导入表达载体构建重组表达载体，然后导入宿主进行培养，收集。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌体或人工染体中的任意一种或多种；所述表达载体进一步优选为质粒；更进一步优选为pET‑24a质粒；
所述宿主包括细菌、真菌和真核细胞，进一步选自埃希氏大肠杆菌、芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、里氏木霉和草酸青霉；更进一步优选为大肠杆菌BL21。
10.权利要求1所述超氧化物歧化酶、权利要求2所述超氧化物歧化酶类似物、权利要求3所述超氧化物歧化酶衍生物或权利要求4所述超氧化物歧化酶变体在生物医药、饲料、食品、化妆品、生物转化领域中的应用；
优选的，所述应用领域为高温和/或酸性环境；
进一步优选的，所述高温环境为不低于30℃；更进一步优选的，所述高温环境为不低于65℃(最优选为75℃)；
进一步优选的，所述酸性环境为pH不高于7，优选为pH为2‑6，进一步优选pH为4。
一种耐高温耐酸的超氧化物歧化酶及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于生物医药、化妆品和食品技术领域，具体涉及一种耐高温耐酸的超氧化物歧化酶及其制备方法和应用。
背景技术
[0002]公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一种能够催化超氧化物阴离子自由基产生歧化
反应的金属类酶，能专一的清除生物体内的超氧阴离子自由基，抵御氧自由基和其他氧化物自由基对细胞质膜、蛋白酶及其它生物大分子和细胞器的损害，并能消除外源氧自由基对机体的损伤，故在维持机体氧自由基平衡方面起重要作用。SOD广泛存在于人类、动物、植物和各类微生物体内。作为清除超氧自由基最有效的酶类，具有抗辐射、抗衰老、抗氧化和防治肿瘤的特性，被广泛应用在化妆品、医药、保健品和食品行业，具有很大的应用潜力和广阔的发展前景。
[0004]SOD按金属辅基分为三类：含铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn‑SOD)、含锰超氧化物歧化酶(Mn‑SOD)和含铁超氧化物歧化酶(Fe‑SOD)。Cu/Zn‑SOD主要存在于真核生物细胞质、叶绿体和细菌细胞质、周质空间中。Mn‑SOD主要存在于原核生物和真核生物的线粒体中。Fe‑SOD存在于原核生物、原生动物、少数藻类和植物中。Ni‑SOD研究相对较少，仅在链霉菌属和蓝细菌中有发现。
[0005]近年来，随着SOD的研究不断深入，其应用也越来越广泛，如：医疗临床、农业、食品工业和化妆品行业等。在医疗临床方面：SOD具有良好的抗炎特性，并已用于临床，对一些炎性疾病(关节炎、类风湿性关节炎等)有良好的疗效；通过静脉注射SOD，能明显缓解患者因化疗导致的骨髓损伤和白血球减少症状；此外SOD在自身免疫疾病、老年白内障、烧伤烫伤、新生儿呼吸困难综合症、辐射病和肺气肿等疾病的效果也比较显著。在农业方面：SOD 的研究主要集中在植物的病害、冻害、衰老、干旱和果蔬贮藏等方面；在某些植物转基因研究中，Fe‑SOD转基因植株表现出更强的抗逆性。在食品工业方面：SOD经化学修饰(肝素化合物、硫酸软骨素、玻璃酸和月桂酸等)和微胶囊化后已商
品化，作为添加剂加入保健品口服液、罐头食品、果汁、酸奶、啤酒等中；通过抑制氧化酶的氧化作用，用于果蔬采后保鲜等。在化妆品行业主要是作为化妆品添加剂：SOD可有效防止皮肤光辐射损伤，有明显的防晒效果；延缓皮肤衰老、祛斑、抗皱，起抗氧化氧化酶的作用；此外，对防治某些皮肤病及瘢痕形成有良好效果，且副作用小。在饲料方面，饲料中添加SOD可以提高肉仔鸡血清免疫指标、肠道抗氧化性能、消化酶活性和改善仔鸡抗氧化能力并改善肉品质。
[0006]如上所述，SOD主要应用在食品、医药、化妆品及农业等领域，在这些领域都要求SOD具有较高的稳定性和活性。传统制备SOD主要来源于植物组织及动物血液和肝脏，产量低，成本高，稳定性差，限制了其应用。利用微生物‑基因工程法高效表达是获得应用所需要
SOD产品的有效途径。与常温SOD相比，来源于极端微生物的SOD不仅对温度具有更高的抗性，而且在耐受物理和化学变性剂方面也表现出较高的稳定性。因此，具有耐热耐酸双重特性的微生物及其产生的耐热耐酸SOD在食品化工方面有着广阔的应用前景。
发明内容
[0007]针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种耐高温耐酸的超氧化物歧化酶及其制备方法和应用。本发明从温泉环境来源的脂环酸芽孢杆菌中克隆的一个SOD基因，并重组进行外源表达，对其酶学特性进行了深入分析，发现其表达的超氧化物歧化酶具有耐高温、耐酸等特性，因此具
有良好的实际应用之价值。
[0008]本发明是通过以下技术方案实现的：
[0009]本发明的第一个方面，提供一种耐高温耐酸的超氧化物歧化酶，所述超氧化物歧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。经试验证明，该超氧化物歧化酶抗氧化酶活达到94.56U/mg(以邻苯三酚自氧化法计)，其在35℃具有最高的抗氧化活性，将其在70℃放置1h 仍具有超过90％剩余活性，在80℃下放置1h仍有75％剩余活性，表明该超氧化物歧化酶具有很强的耐热性；同时，其能够在pH4.0时发挥良好的酶活活性，且该酶活性中心对Fe2+和Mn2+没有选择性，蛋白质在折叠过程中结合两种离子的能力是几乎相同的，能够影响该酶结合的为两种离子在溶液中的浓度。更重要的，活性中心为Mn2+的超氧化物歧化酶其抗氧化活性约为结合Fe2+的十倍。
[0010]本发明的第二个方面，提供一种超氧化物歧化酶类似物，其具有与所述超氧化物歧化酶相同的生物活性，所述超氧化物歧化酶类似物是指在用所述超氧化物歧化酶和另一种化合物融合或者用所述超氧化物歧化酶的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白质而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白质。
[0011]本发明的第三个方面，提供一种超氧化物歧化酶衍生物，其氨基酸序列具有与所述超氧化物歧化酶氨基酸主序列≥70％的一致性，≥90％的相似性，该衍生物是指把所述超氧化物歧化酶的氨基酸序列中的一个或者几个氨基酸的某个基团用另外的基团取代后且与所述超氧化物歧化酶具有同样生物活
性的超氧化物歧化酶。
[0012]本发明的第四个方面，提供一种超氧化物歧化酶变体，其氨基酸序列具有与超氧化物歧化酶氨基酸主序列≥70％的一致性，≥90％的相似性，该变体是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列，所述改变包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中间的任一位置缺失、插入或替换氨基酸或核苷酸，或在序列两端添加氨基酸或核苷酸，所述超氧化物歧化酶变体具有与上述超氧化物歧化酶相同的生物活性。
[0013]本发明的第五个方面，提供编码所述超氧化物歧化酶、超氧化物歧化酶类似物、超氧化物歧化酶衍生物或超氧化物歧化酶变体的核苷酸，其包含下组中的任一种：[0014]a)编码具有所述氨基酸序列的多肽或类似物、衍生物或其变体的核苷酸；[0015]b)与a)所述核苷酸互补的核苷酸；
[0016]c)与a)或b)中所述核苷酸具有≥75％序列一致性的核苷酸。
[0017]所述核苷酸可采用人工合成方法制备。
[0018]其中，所述a)中，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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