(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.03.26
C N 103688177
A (21)申请号 201280029832.5
(22)申请日 2012.06.15
2011-135174 2011.06.17 JP
G01N 33/86(2006.01)(71)申请人学校法人东日本学园
地址日本北海道
申请人积水医疗株式会社
(72)发明人家子正裕 森川千鹤 服部惠子
(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限
公司 11227
代理人金世煜 苗堃
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供一种血液凝固时间的测定方法，
其即使对于华法林服用者、维生素K 缺乏者或者
肝功能不全患者的血液试样，也不受到血液凝固
易且敏感度良好地进行LA 检测。一种狼疮抗凝物
检测用血液凝固时间的测定方法，其特征在于，在
血液凝固时间的测定前或者测定时，向血液试样
中添加含有血液凝固因子的缓冲液组合物来测定
血液凝固时间。
(30)优先权数据
(85)PCT国际申请进入国家阶段日
2013.12.17
(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/JP2012/065434 2012.06.15
(87)PCT国际申请的公布数据
WO2012/173260 JA 2012.12.20
(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书10页 附图4页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书10页 附图4页(10)申请公布号CN 103688177 A
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1.一种狼疮抗凝物检测用血液凝固时间的测定方法，其特征在于，在血液凝固时间的测定前或者测定时，向血液试样中添加含有血液凝固因子的缓冲液组合物，测定血液凝固时间。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其中，血液凝固因子是选自FII 、FVII 、FVIII 、FIX 、FX 、FXI 以及FXII 中的1种或2种以上。
3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其中，血液试样是全血或者血浆。 4.根据权利要求1～3中任一项所述的测定方法，其中，在血液凝固时间的测定前，向血液试样中添加含有血液凝固因子的缓冲液组合物。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的测定方法，其中，血液试样来自选自华法林服用者、维生素K 缺乏者以及肝功能不全患者中的患者。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的测定方法，其中，血液凝固时间的测定手段为活化部分凝血活酶时间或者稀释拉塞尔蛇毒时间。
7.一种辅助试剂，以含有血液凝固因子的缓冲液组合物为主成分，与狼疮抗凝物检测用血液凝固时间测定用试剂组合使用。
8.根据权利要求7所述的辅助试剂，其中，狼疮抗凝物检测用血液凝固时间测定用试剂被用于活化部分凝血活酶时间或者稀释拉塞尔蛇毒时间的测定。
9.一种狼疮抗凝物检测用血液凝固时间测定用试剂盒，含有以下的（A ）、（B ）：
（A ）活化部分凝血活酶时间测定用试剂或者稀释拉塞尔蛇毒时间测定用试剂，
（B ）以含有血液凝固因子的缓冲液组合物为主成分的辅助试剂。权 利 要 求 书CN 103688177 A
狼疮抗凝物检测用血液凝固时间的测定方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种以检测狼疮抗凝物为目的，测定被检血液试样的血液凝固时间的方法。
背景技术
[0002] 血液凝固时间测定是测定从将由血液凝固因子的活化剂（以下，有时也简称为活化剂）和/或Ca2+等构成的血液凝固时间测定用试剂添加于样品血液或样品血液混合物的时刻，到形成可检测的纤维蛋白凝块为止的时间（血液凝固时间：以下，有时也简称为凝血时间。另外，有时也将纤维蛋白凝
块的形成简称为凝固），是为了筛选血液凝固体系异常的有无，或者测定各个血液凝固因子的活性而实施的。作为典型的例子，有凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间等的血液凝固试验。以下，在本说明书中，有时也将血液凝固因子简称为凝血因子。
[0003] PT是从向被检血浆中添加组织凝血活酶和Ca2+的混合液到凝固为止的时间，是综合性地检查与外源性凝血机制有关的第VII因子、第X因子、第V因子、凝血酶原、纤维蛋白原等的凝血活性的时间。另外，APTT是从向被检血浆中添加足够量的磷脂以及活化剂（高岭土、无水硅酸、鞣花酸等）和适量的Ca2+到凝固为止的时间，是综合性地检查与内源性凝血机制有关的第XII因子、第XI因子、前激肽释放酶、高分子激肽原、第IX因子、第VIII因子、第X因子、第V因子、凝血酶原、纤维蛋白原等的凝血活性的时间。通常，这些血液凝固试验中的异常是指凝血时间延长。血液凝固体系的异常反映生物体内的出血趋势或者血栓趋势（血液凝固趋势）的先兆或结果。
[0004] 作为该凝血时间的延长原因，认为是：1）血液凝固因子的缺乏或者降低；2）存在针对构成血液凝固体系的血液成分的抗体；3）存在针对血液凝固时间测定用试剂中的成分的抗体；4）存在针对构成血液凝固体系的血液成分与血液凝固时间测定用试剂中的成分的复合体的抗体；5）阻碍血液凝固反应的药剂的给药等。
[0005] 但是，仅进行血液凝固时间的测定时，无法鉴别凝血时间的延长原因是例如单纯由于凝血因子
缺乏而引起的血液凝固活性的降低，还是针对构成血液凝固体系的成分或者血液凝固时间测定用试剂中的成分等的抗体（抑制因子）阻碍凝血反应而引起的血液凝固活性的降低等。另一方面，因该延长原因的不同，导致方针不同，所以该延长原因的鉴别是重要的。因此，为了鉴别该延长原因，进行血液凝固补正试验（以下，有时也称为“混合试验”或“Mixing text”），即，向被检血浆中添加正常血浆，将其血液凝固时间被补正（正常化）的程度制图并进行判定（非专利文献1）。
[0006] 以往，混合试验例如如下实施。
[0007] 准备相对于被检血浆，以正常血浆的混合比例成为0%、20%、50%、80%、100%的方式添加、混合正常血浆而制备得到的试样，进行APTT的测定。将其结果制成图（横轴：混合后的正常血浆的比例或者被检血浆的比例（%），纵轴：凝血时间（秒）），根据该图的形状目视鉴别、判定凝血时间的延长原因。例如，被检血浆缺乏凝血因子时，少量添加正常血浆（在图1
（A）为20%）时，使凝血时间大幅度缩短，接近于测定正常血浆100%时的值，因此显示出与连接被检血浆100%与正常血浆100%的点的直线（虚线）相比向下凸出的曲线（图1（A））。[0008] 被检血浆中存在凝血因子抑制因子时，即使提高正常血浆的添加比例，该凝血因子抑制因子也使添加的正常血浆中的凝血因子失活，所以由添加正常血浆产生的凝血时间的改善程度小，显示向上凸出的曲线（图1（B））。
[0009] 作为影响血液凝固时间测定用试剂的感受性的凝血因子抑制因子，已知有狼疮抗凝物（以下，LA）。LA被定义为一种不阻碍每个凝血因子活性地阻碍体外的磷脂依赖性凝血反应的免疫球蛋白，而并非单一的抗体。由于凝血反应中必须存在磷脂，所以通常很多血液凝固时间测定用试剂中含有丰富的磷脂。LA与该试剂中的磷脂反应，将其消耗，结果阻碍凝血反应而使凝血时间延长，所以经常发现像PT、APTT这样的凝血检查的结果异常。但是，LA因磷脂的种类（来源、磷脂的组成等）不同而反应强度不同，所以根据所使用的血液凝固时间测定用试剂，LA阳性·阴性的判定结果也不同。
[0010] 非专利文献1：检查与技术，Vol.34，no.8，2006年8月，p735-742
[0011] 非专利文献2:Update of the guidelines for lupus anticoagulant detection,Journal of Thrombosis and Haemostasis,7：pp1737-1740，2009
发明内容
[0012] 作为抗凝血疗法，紧急时，使用有速效性且可静脉内给药的肝素，通过长期给药来预防时，使用作为口服抗凝血药的华法林。其中，已知华法林通过对生物体内的维生素K的作用进行拮抗，从而抑制血液凝固因子中的第II因子（凝血酶原）、第VII因子、第IX因子、第X因子在肝脏中的生物合成。因此，对于华法林服用者、维生素K缺乏者、或者肝功能不全患者（肝硬化、暴发型肝炎、或者慢性肝炎患者等）而言，在基于以往的混合试验的血液凝固时间的延长原因的确认方法中，不明确是由于LA等
抗磷脂抗体引起的凝血时间的延长，还是由于基于华法林的作用、维生素K的缺乏、或者肝功能不全的血液凝固因子的缺乏而引起的凝血时间的延长，难以鉴别原因。该问题在接受华法林给药进而为LA阳性的情况下更为深刻。这是因为确认或者怀疑LA阳性并开始抗凝血疗法时，LA的检测和其消长的监视、追踪是重要的，但无法正确地进行。
[0013] 国际血栓止血学会（ISTH）推荐，在进行LA检测时，为了补充不足的凝血因子，向被检血浆中混合等量的健康者血浆后进行测定。此处，对于所使用的健康者血浆，进行二次离心处理，以使血小板数低于107/mL，且各家自行制备所有血液凝固因子的活性几乎为100%的血浆而使用（非专利文献2）。但是，血液凝固因子中，还有活性非常不稳定且容易失活的血液凝固因子，所以将所有血液凝固因子的活性几乎100%地保持地制备健康者血浆是非常困难的，存在不容易稳定获得的问题。另外，在健康者血浆的制备中，虽然储留（存积）、混合的人数越多，越能够使凝血因子活性的每个人的波动平均化，但因设备而导致无法确保健康者的人数，血浆提供者出现偏差，所以还存在批次间的品质产生差别的问题。进而，使用健康者血浆的方法不仅会稀释被检血浆中的LA，有时也会添加健康者血浆中所含的妨碍LA测定的物质（来自磷脂、血小板的膜破碎物等），特别是LA呈弱阳性时，还存在可能发生假阴性化的问题。
[0014] 因此，迫切期望开发一种血液凝固时间的测定方法，该方法即使对于华法林服用
者、维生素K缺乏者或者肝功能不全患者，也不受血液凝固因子的缺乏的影响，与上述ISTH 的推荐法相比，可容易且敏感度良好地进行LA检测。
[0015] 本发明人等进行了深入的研究，其结果发现，通过在将特定的血液凝固因子而不是健康者血浆添加于被检试样（例如血浆）后测定血液凝固时间，从而即使不使用健康者血浆，也能够简便且敏锐地测定检测用的血液凝固时间，从而完成了本发明。
[0016] 即，本发明提供一种LA检测用血液凝固时间的测定方法，其特征在于，在血液凝固时间的测定前或者测定时，向血液试样中添加含有血液凝固因子的缓冲液组合物来测定血液凝固时间。
[0017] 另外，本发明提供一种辅助试剂，其以含有血液凝固因子的缓冲液组合物为主成分，且与狼疮抗凝物检测用血液凝固时间测定用试剂组合使用。
[0018] 进而，本发明提供一种狼疮抗凝物检测用血液凝固时间测定用试剂盒，其含有以下的（A）、（B）。
[0019] （A）活化部分凝血活酶时间测定用试剂或者稀释拉塞尔蛇毒时间测定用试剂[0020] （B）以含有血液凝固因子的缓冲液组合物为主成分的辅助试剂。
[0021] 根据本发明方法，即使来自华法林服用者、维生素K缺乏者或者肝功能不全患者（肝硬化、暴
发型肝炎、或者慢性肝炎患者等）的血液试样等缺乏维生素K依赖性凝血因子（FII、FVII、FIX、以及FX），也能够简便且敏锐地确认LA的有无。因此，能够决定具有LA的患者的正确方针。另外，由于不需要准备健康者血浆，所以也能够消除以往成为问题的健康者血浆的批次间差别、难以稳定获得的问题。此外，本发明方法特别值得一提之处是，能够简便且敏锐地检测目前为止即使利用健康者血浆的混合试验也可能漏检的LA。这是无法根据将以往的健康血浆的添加置换为各个血浆成分的添加这样的单纯构思来预测的、完全预料不到的效果。
附图说明
[0022] 图1是表示基于以往方法的混合试验的结果的模式图。图1（A）表示凝血因子缺乏症的图形，图1（B）表示凝血因子抑制因子型的图形，图1（C）表示凝血时间的延长原因不明确时的图形。
[0023] 图2是表示分别以未处理血浆A和添加正常血浆的血浆A为样本时的混合试验的结果的图。
[0024] 图3是表示分别以未处理血浆B和添加正常血浆的血浆B为样本时的混合试验的结果的图。
[0025] 图4是表示以添加有辅助试剂1-4的血浆A为样本时的混合试验的结果的图。[0026] 图5是表示以添加有辅助试剂1-4的血浆B为样本时的混合试验的结果的图。
具体实施方式
[0027] 本发明的LA检测用血液凝固时间的测定方法的特征在于，在血液凝固时间的测定前或者测定时，向血液试样中添加含有血液凝固因子的缓冲液组合物。
[0028] 本发明方法所使用的血液试样优选全血或者血浆，通常，向从被检者采集的血液中加入枸橼酸钠等抗凝血剂来制备。在这些血液试样中，对于将以往难以进行LA检测的来
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