[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1537939A [43]公开日2004年10月20日
[21]申请号03134847.5[22]申请日2003.09.25
[21]申请号03134847.5
[30]优先权
[32]2003.04.16 [33]US [31]60/463,632
[32]2003.08.26 [33]US [31]60/498,134
[71]申请人普罗特奥姆技术公司
地址美国加利福尼亚州
[72]发明人蔺新力 [74]专利代理机构北京市中咨律师事务所代理人黄革生 林柏楠
[51]Int.CI 7C12N 9/72C07K 1/14
权利要求书 2 页 说明书 15 页 附图 3 页
[54]发明名称
[57]摘要
其后通过在低浓度离液剂存在下缓慢降低pH使变性
03134847.5权 利 要 求 书第1/2页 1.生产再折叠重组尿激酶原的方法，其包括：
用溶解缓冲液溶解变性的尿激酶原蛋白质，所述溶解缓冲液包含高浓度的离液剂、还原剂，并且其具有约9.0到约11.0的pH，由此产生溶解的尿激酶原溶液；
通过将上述溶解的尿激酶原溶液加至再折叠缓冲液中将上述溶解的尿激酶原溶液用再折叠缓冲液快速稀释，由此产生稀释的溶解的尿激酶原溶液；
将稀释的溶解的尿激酶原溶液的pH降低至约7.5到约8.5，其中所述pH的降低用至少约20小时的时间完成，由此产生再折叠的尿激酶原。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的尿激酶原为人尿激酶原。
3.权利要求1-2任意一项所述的方法，其中所述的离液剂为尿素。
4.权利要求3所述的方法，其中所述尿素的浓度为约8M。
5.权利要求1-2任意一项所述的方法，其中所述的离液剂为盐酸胍。
6.权利要求5所述的方法，其中所述盐酸胍的浓度为约6M。
7.前述权利要求任意一项所述的方法，其中所述溶解缓冲液的pH 为约10.0到约10.5。
8.前述权利要求任意一项所述的方法，其中将所述稀释的溶解的尿激酶原溶液的pH降低至约8.0。
9.前述权利要求任意一项所述的方法，其还包括调节变性的尿激酶原溶液的A280到约5.0至约10.0。
10.前述权利要求任意一项所述的方法，其中用再折叠缓冲液将变性的尿激酶原溶液稀释约20倍。
11.前述权利要求任意一项所述的方法，其中用再折叠缓冲液稀释变性的尿激酶原溶液，所述再折叠缓冲液包含约0.8M到约2.5M的尿素和约0.05M到约1.5M的精氨酸。
03134847.5权 利 要 求 书 第2/2页 12.权利要求11所述的方法，其中所述的再折叠缓冲液包含约2.0M 的尿素和约0.2M的精氨酸。
13.权利要求1所述的方法，其中所述的溶解缓冲液包含约8M的尿素和约100mM的β-巯基乙醇，并且其pH约为10.5；将所述溶解的尿激酶原溶液调节至A280为约5.0，然后在再折叠缓冲液中快速稀释约20倍，并且所述再折叠缓冲液包含约2M尿素、约0.2M精氨酸、氧化型和还原型谷胱甘肽。
14.权利要求1所述的方法，其中所述的溶解缓冲液包含约8M的尿素和约100mM的β-巯基乙醇，并且其pH约为10.5；将所述溶解的尿激酶原溶液调节至A280为约5.0，然后在再折叠缓冲液中快速稀释约20倍，并且所述再折叠缓冲液包含约1M盐酸胍、约0.2M精氨酸、氧化型和还原型谷胱甘肽。
15.前述权利要求任意一项所述的方法，其还包括裂解含有变性尿激酶原蛋白质的细菌宿主细胞以及收集所述变性的尿激酶原蛋白质。
16.权利要求15所述的方法，其还包括洗涤所述变性的尿激酶原蛋白质。
17.前述权利要求任意一项所述的方法，其还包括纯化所述再折叠的尿激酶原。
18.权利要求17所述的方法，其中，将所述再折叠的尿激酶原通过大小排阻层析(SEC)纯化。
19.权利要求17或18所述的方法，其中，将所述再折叠的尿激酶原通过离子交换层析(IEC)纯化。
20.权利要求17或18所述的方法，其中，将所述再折叠的尿激酶原通过肝素亲合层析纯化。
21.权利要求17、18和20中任意一项所述的方法，其中，将所述再折叠的尿激酶原通过羟磷灰石层析纯化。
22.利用前述任意一项权利要求所述的方法生产的再折叠的尿激酶原。
03134847.5说 明 书第1/15页
生产重组尿激酶的方法
相关申请的相互引用参考
本申请要求美国临时专利申请60/463,632(2003年4月16日提交)以及美国临时专利申请60/498,134(2003年8月26日提交)的优先权，这两项申请全文引入本文作为参考。
发明背景
尿激酶是一种丝氨酸蛋白酶，该酶切割纤溶酶原产生活性的纤溶酶，因此在纤维蛋白溶解作用中起重要作用。临床上，此活性已被用于活性的血栓形成，包括血栓形成性中风、肺栓塞、深静脉血栓形成等等。 尿激酶最初以411个氨基酸的前体蛋白质形式被合成，其具有12个链内二硫键。尿激酶原通过蛋白水解作用而活化为成熟的尿激酶，在上述蛋白水解作用中主链在L y s158后断裂，从而生成由二硫键相连的双链分子。临床应用的尿激酶纯化自收集的尿，这存在安全和再现性方面的忧虑。 尿激酶的重组形式已经有所报道，其包括“低分子量尿激酶”(其氨基末端125个氨基酸被删除)及其它变体。参见O r s i n i等人(1991，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Bioch.)195：691-97)、Liu等人(2002，循环研究(Circ.Res.) 90：757-63)、Tang等人(1997，蛋白质表达纯化(Prot.Express.Purif.)11：279-83)、Winkler等人(1986，生物化学(Biochem.)25：4041-45)以及美国专利号5,188,829、5,219,569和5,472,692。
当在细菌中高水平表达时，尿激酶原以不溶的“包含体”或“折射体”的形式聚积。这些不溶的颗粒中所含的蛋白质系错误折叠，并且其在折叠成正确构象之前必须经过“解折叠”(变性，包括错误配对二硫键的还原)。许多再折叠的“一般”实验方案已有报道，包括美国专利号4,511,503、4,599,197和美国专利公开号2001/0044521(美国专利号6,583,268)。
03134847.5说 明 书 第2/15页 在此引用的所有专利、专利申请和出版物均全文引入作为参考。需要指出的是，本发明背景部分中参考某一出版物并不表示承认所述出版物构成了本发明所指的现有技术。
发明概述
本发明人发现了生产具酶学活性尿激酶的简单高效的方法。该方法利用粗制的由细菌产生的尿激酶原(例如细胞糊状物或包含体)，并经仅仅几个步骤就生成正确折叠、高活性的尿激酶原或尿激酶。本发明所述的方法可以达到至少20％-40％的总收率，并可用于生产活性至少为每毫克蛋白质约100,000国际单位(IU/mg)的尿激酶。重要的是，本发明人已经发现根据本发明生产的尿激酶在溶液中高度稳定，因此其尤其适用于尿激酶的液体制剂形式。
总的来说，本发明提供从细菌细胞含尿激酶原的包含体生产具酶学活性的尿激酶或尿激酶原的方法，所述方法包括在高p H(即大于约p H9)的缓冲液中溶解包含体蛋白质，并通过减少离液剂浓度和缓慢降低p H至中性(即p H7.5-8.5)使蛋白质再折叠，所述高p H缓冲液含有二硫化物还原剂及高浓度离液剂(例如8M尿素或6M盐酸胍)。然后可以将再折叠尿激酶原纯化。在再折叠蛋白质纯化前或纯化后，利用适当的丝氨酸蛋白酶(如纤溶酶或胰蛋白酶)消化再折叠的尿激酶原，从而得到尿激酶。
本发明提供生产再折叠重组尿激酶原的方法，所述方法包括利用溶解缓冲液溶解变性的尿激酶原蛋白
质以产生溶解的尿激酶原溶液，通过将溶解的尿激酶原溶液加入到再折叠缓冲液中将尿激酶原溶液用再折叠缓冲液快速稀释，从而形成稀释的尿激酶原溶液，将尿激酶原溶液的p H降低至约7.5到约8.5，由此产生再折叠的尿激酶原，其中所述的p H降低用至少约20小时的时间来完成，所述的溶解缓冲液含有高浓度离液剂、还原剂并且其pH为约9.0到约11.0。
在某些实施方案中，尿激酶原为人尿激酶原。
豫公网安备41160202000603
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