(19)国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202210288304.7
(22)申请日 2022.03.22
(71)申请人 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院
有限公司
地址 241000 安徽省芜湖市芜湖经济技术
开发区衡山路汽车电子孵化中心
B0401-B0402
(72)发明人 赵俊 朱何龙 刘家炉 李媛媛
周炜 夏兵兵 何志远 许高涛
王梦
(74)专利代理机构 芜湖安汇知识产权代理有限
公司 34107
专利代理师 尹婷婷
(51)Int.Cl.
A61K 8/64(2006.01)
A61K 8/02(2006.01)A61K 8/34(2006.01)A61K 8/60(2006.01)A61Q 19/00(2006.01)A61Q 19/08(2006.01)
(54)发明名称
白组合物冻干微芯及其制备方法
(57)摘要
本发明公开了一种具有皮肤屏障修复功效
所述冻干微芯包括以下重量百分比的原料：纤连
蛋白10‑15ppm，血小板衍生生长因子10‑15ppm，
金属硫蛋白Ⅳ型10‑15ppm，弹性蛋白10‑15ppm，
丝聚蛋白20‑40ppm，冻干保护液，余量为水；其为
生物功效性产品，具有促细胞增殖活性和促细胞
迁移活性，在乳酸刺痛实验中显示具有舒缓刺痛
的功效，且制备时不添加防腐剂、人工化学成分，
对皮肤无刺激。权利要求书1页 说明书8页CN 114557908 A 2022.05.31
C N 114557908
A
1.一种具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯，其特征在于，所述冻干微芯包括以下重量百分比的原料：纤连蛋白10‑15ppm，血小板衍生生长因子10‑15ppm，金属硫蛋白Ⅳ型10‑15ppm，弹性蛋白10‑15ppm，丝聚蛋白20‑40ppm，冻干保护液，余量为水。
2.根据权利要求1所述的具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯，其特征在于，所述冻干保护液的重量百分比为10‑15％。
3.根据权利要求1所述的具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯，其特征在于，所述冻干保护液中各原料的重量比如下：甘露醇：甘氨酸：海藻糖＝4‑8：4‑8：1。
4.根据权利要求1‑3任意一项所述的具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯，其特征在于，所述冻干微芯包括以下重量百分比的原料：纤连蛋白15ppm，血小板衍生生长因子15ppm，金属硫蛋白Ⅳ型15ppm，弹性蛋白15ppm，丝聚蛋白20ppm，甘露醇6％，甘氨酸6％，海藻糖1％，余量为水。
5.根据权利要求1‑3任意一项所述的具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯，其特征在于，所述冻干微芯包括以下重量百分比的原料：纤连蛋白10ppm，血小板衍生生长因子10ppm，金属硫蛋白Ⅳ型10ppm，弹性蛋白10ppm，丝聚蛋白40ppm，甘露醇6％，甘氨酸6％，海藻糖1％，余量为水。
6.根据权利要求1‑5任意一项所述的具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将配方量的各原料混合得到混合液；
(2)利用高精度流体分装系统，将混合溶液逐滴滴入存于杜瓦瓶的液氮中冷冻成微芯；
(3)将微芯取出装入西林瓶中，进行冷冻干燥。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，每滴混合溶液的体积为5‑60μL。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，每个西林瓶中装入2‑20粒冷冻后的微芯。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥具体为：35～45Kpa的真空度下‑35‑45℃预冻170‑190min，并在同样的条件下冻结220～260min，随后在5～15Pa的真空度下进行一期升华干燥及二期升华干燥。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述一期升华干燥的程序设计为‑34～‑38℃保持55～65min，‑31～‑33℃保持150～200min，‑28～‑30℃保持400～450min，‑20～‑27℃保持220～260min，‑10～‑18℃保持220～260min，‑5～‑5℃保持100～140min；所述二期升华干燥的程序设计为20～25℃保持280‑320min，28～‑30℃保持280‑320min。
权 利 要 求 书1/1页CN 114557908 A
一种具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯
及其制备方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯及其制备方法。
背景技术
[0002]敏感性皮肤是一种皮肤高度敏感的状态，在这种状态下皮肤极易受到外界因素影响，出现皮肤瘙痒、紧绷、烧灼、刺痛等不适。研究显示，全球范围内的敏感肌肤正在日益增加，敏感性皮肤在亚洲女性中发生率为40％～55％，其中我国女性的发生率在36.1％。敏感性皮肤作为现代社会人中发生率极高的皮肤问题，已经严重影响着人们的学习、工作和生活。市场上宣称具有敏感肌修复效果的护肤类产品琳琅满目，不乏一些功效差，甚至对皮肤有害的产品。
[0003]随着基因工程技术的不断发展，生物功效性护肤品也逐渐获得人们的青睐。该技术制备的功效性蛋白护肤品无论从生物学活性、皮肤亲和性、生物相容性等等均显著优于传统的化妆品。此外生物护肤品以生物活性蛋白为核心，注重产品有效成分对生物活性的保持，不添加防腐剂，不添加人工化学成分，对皮肤无刺激，能快速修复皮肤屏障，对皮肤修护功效优于传统化妆品，但是在敏感肌修复方面尚无类似产品。
发明内容
[0004]为解决上述技术问题，本发明提供了一种具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯及其制备方法，所述冻干微芯为生物功效性产品，具有促细胞增殖活性和促细胞迁移活性，在乳酸刺痛实验中显示具有舒缓刺痛的功效，且制备时不添加防腐剂、人工化学成分，对皮肤无刺激。
[0005]为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
[0006]一种具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯，所述冻干微芯包括以下重量百分比的原料：纤连蛋白10‑15ppm，血小板衍生生长因子10‑15ppm，金属硫蛋白Ⅳ型10‑15ppm，弹性蛋白10‑15ppm，丝聚蛋白20‑40ppm，冻干保护液，余量为水。
[0007]所述冻干保护液的重量百分比为10‑15％。
[0008]所述冻干保护液中各原料的重量比如下：甘露醇：甘氨酸：海藻糖＝4‑8：4‑8：1. [0009]所述冻干微芯优选为包括以下重量百分比的原料：纤连蛋白15ppm，血小板衍生生长因子15ppm，金属硫蛋白Ⅳ型15ppm，弹性蛋白15ppm，丝聚蛋白20ppm，甘露醇6％，甘氨酸6％，海藻糖1％，余量为水。
[0010]所述冻干微芯优选为包括以下重量百分比的原料：纤连蛋白10ppm，血小板衍生生长因子10ppm，金属硫蛋白Ⅳ型10ppm，弹性蛋白10ppm，丝聚蛋白40ppm，甘露醇6％，甘氨酸6％，海藻糖1％，余量为水。
[0011]本发明还提供了所述具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯的
制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0012](1)将配方量的各原料混合得到混合液；
[0013](2)利用高精度流体分装系统，将混合溶液逐滴滴入存于杜瓦瓶的液氮中冷冻成微芯；
[0014](3)将微芯取出装入西林瓶中，进行冷冻干燥。
[0015]步骤(2)中，每滴混合溶液的体积为5‑60μL，优选为5‑15μL，更优选为10μL。[0016]步骤(3)中，每个西林瓶中装入2‑20粒冷冻后的微芯。
[0017]所述冷冻干燥具体为：35～45Kpa的真空度下‑35‑45℃预冻170‑190min，并在同样的条件下冻结220～260min，随后在5～15Pa的真空度下进行一期升华干燥及二期升华干燥。
[0018]所述一期升华干燥的程序设计为：‑34～‑38℃保持55～65min，‑31～‑33℃保持150～200min，‑28～‑30℃保持400～450min，‑20～‑27℃保持220～260min，‑10～‑18℃保持220～260min，‑5～‑5℃保持100～140min；所述二期升华干燥的程序设计为：20～25℃保持280‑320min，28～‑30℃保持280‑320min。
[0019]本发明提供的具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯的使用方法为：将适量纯化水加入到含有冻干微芯的西林瓶中，混合待微芯完全溶解后，即可使用。[0020]本发明提供的具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯的配方中，纤连蛋白(FN)广泛参与细胞迁移、黏附、增殖、止血及组织修复等过程，调动单核吞噬细胞系统清除损伤组织处有害物质，具有生长因子作用；血小板衍生生长因子(PDGF)能促进皮肤细胞的生长与更新，提升皮肤组织的生理活性与新陈代谢水平，增强皮肤细胞的免疫力与自我修复能力，修复由于日光、严寒、化学物质与机械磨损伤害造成的红血丝与敏感肌肤；金属硫蛋白是富含半胱氨酸的金属结合蛋白，其巯基能强烈螯合有毒金属，并将之排出体外，从而实现解毒功能，金属硫蛋白可清除自由基实现抗衰老、抗氧化及细胞凋亡；弹性纤维可提高皮肤的延展性和回弹性，使皮肤具有良好的柔韧性和弹性；丝聚蛋白可与皮肤内的相关蛋白共同组成角质包膜而成为皮肤屏障的重要组成部分，可防止皮肤水分丢失、提升皮肤的免疫屏障。
[0021]本发明提供的具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯为生物功效性产品，易吸收，对皮肤无任何副作用，具有促细胞增殖活性和促细胞迁移活性，在乳酸刺痛实验中显示具有舒缓刺痛的功效，且制备时不添加防腐剂、人工化学成分，对皮肤无刺激，能修复敏感肌。其制备形式相较于普通的冻干粉，更有效的降低了冻干过程对于重组蛋白的活性损失。
具体实施方式
[0022]本发明所涉及的纤连蛋白的制备方法如下：
[0023](1)通过GenBank查询获得纤连蛋白(FN)基因，将FN基因序列插入到pMD19‑T Simple Vector中，其5’端接NotⅠ酶切位点(GCGGCCGC)，3’端接XbaⅠ酶切位点(TCTAGA)，由此得到质粒pMD19‑T‑FN；
[0024](2)用内切酶Not I和内切酶Xba I分别对质粒pYES2/CT‑MFα及质粒pMD19‑T‑FN进行双酶切，酶切反应体系为：
[0025]双酶切体系体积(μL)
QuickCut Not I 2.0
QuickCut Xba I 2.0
10xQuickCut Green Buffer5
pYES2/CT‑MFa或FN片段15
O26
ddH
2
Total Volume50
[0026]在37℃金属浴酶切反应3h，酶切产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并分别切胶回收FN基因片段和pYES2/CT‑MFα载体，然后用T4 DNA连接酶进行连接，连接反应体系为：[0027]连接体系体积(μL)
FN基因片段5
pYES2/CT‑MFα3
T4 DNA连接酶1
10×ligase buffer1
Total Volume10
[0028]反应条件为16℃、14h，将重组质粒转化至大肠杆菌(DH5ɑ)，在含氨苄青霉素的LB 平板培养基
上挑取阳性克隆，经菌液PCR及双酶切鉴定，选取阳性克隆pYES2/CT‑MFα‑FN；[0029](3)将10μL pYES2/CT‑MFα‑FN质粒加到80μl酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，然后转移到预冷的电击杯中，冰浴5min，擦干电击杯外壁；将Bio‑Rad电转化仪调至真菌档，PIC选项，电击杯置于Bio‑Rad电转化仪上电击，迅速向电击杯中加入500μl 预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，涂SC‑U板；30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆。在SC‑U选择培养基(含氨苄)生长的为含有pYES2/CT‑MFα‑FN的酿酒酵母转化子，菌液PCR筛选出IN VSc1/pYES2/CT‑MFα‑FN阳性克隆子。
[0030](4)挑取INVSc1/pYES2/CT‑MFα‑FN单菌落接种于20ml SC‑U选择培养基，经30℃、
吸光值，计算好相应体积的菌液转接至于100ml SC‑U诱220rpm震荡培养过夜，测定其OD
600nm
达到0.4；然后在4℃、1500g离心5min，收集菌体，用1～2ml的导培养基中，使得初始OD
600nm
SC‑U诱导培养基悬浮菌体，重新接种100ml的SC‑U诱导培养基中，置于30℃震荡培养96h，4℃、15000g离心5min，收集菌体和上清，诱导表达的上清液经离心并通过0.22μm滤膜过滤，收集过滤液。
[0031](5)取离心并经0.22μm滤膜过滤后的过滤液，使用GE Healthcare公司C helating Sepharose TM Fast Flow镍离子螯合亲和层析填料自行装柱，用3个柱体积的纯化水清洗Ni2+螯合亲和层析柱，再用PBS平衡2‑3个柱体积；在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速5‑6ml/min；再用PBS过层析柱，洗
稳定，再以含500mM咪唑PBS缓冲液过层析柱，洗脱去未与层析柱结合的杂蛋白，直到OD
280nm
并收集洗脱峰对应的蛋白，即得到经过金属离子亲和层析后的重组人FN蛋白原液。[0032](6)将金属离子亲和层析纯化后收集的蛋白原液置换到Binding BufferⅡ中后，上样通过用Binding BufferⅡ平衡好的DEAE阴离子交换层析柱，收集FN融合蛋白峰；再用Elution BufferⅡ(50mM三羟甲基氨基甲烷，1M NaCl，pH8.5)洗脱，洗去杂蛋白并收集洗脱峰对应的蛋白。即可制备得到酸性成纤维细胞生长因子的蛋白原液，此原液直接作为冻干
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