摘要
细胞外囊泡（EV）能够携带包括核酸、蛋白和小分子代谢物在内的多种生物活性成分，其在肿瘤诊断与中的价值已得到广泛认可。然而目前对于EV内含物的研究主要集中在RNA和蛋白质上，对于最能直接反映细胞状态的小分子代谢物在EV中的作用尚不明确。近年来EV代谢组学在肿瘤研究中逐渐受到了关注，尽管由于前处理复杂且代谢物含量较低，EV 代谢组学研究仍存在诸多挑战，但其在调控肿瘤进展及作为肿瘤标志物方面的价值已逐步显现，有望为肿瘤的诊断与提供新的靶点。 细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）是一种具有双层磷脂膜结构的囊泡小体，EV从其大小及分离方式上可以分为小细胞外囊泡（small extracellular vesicles，sEV）和大细胞外囊泡（large extracellular vesicles，lEV），而从其产生方式上又可以分为外泌体、微囊泡、凋亡小体等［1］。EV能够特异地将来源细胞的蛋白质、核酸和代谢物等物质包裹在内，它们作为EV携带的“货物”，一方面能够作为标志物反映来源细胞的状态，另一方面也能够在细胞间传递信息，诱导靶细胞的生命活动发生改变［2］。此外本团队的前期研究也证实EV在肿瘤的远处转移中也发挥着重要作用［3］。 细胞代谢的改变是肿瘤的重要特征，肿瘤细胞可以通过这些改变来满足自
身快速生长的需求。小分子代谢物是与细胞表型和状态最直接相关的分子，随着研究的深入，人们越来越认识到了代谢组学在肿瘤中的重要价值［4］。然而目前肿瘤EV的相关报道大都集中于RNA和蛋白，EV代谢组学研究还相对欠缺。
一、肿瘤来源EV的代谢组学特征
首先，与来源细胞相比，EV含有更多的脂质（每毫克蛋白所含脂质约为细胞的8.4倍）［5］，且普遍存在胆固醇、鞘糖脂、鞘磷脂等脂质的富集［6］，这一点在前列腺癌［5，7］、结直肠癌［8］和乳腺癌［9］细胞来源的EV中都得到了证实。此外EV还会特异性富集一些脂质，例如有研究发现，溶血磷脂酰胆碱会在前列腺癌LnCap细胞来源的EV中富集，但其在LnCap细胞中的丰度却很低。此外不同EV亚类携带的代谢物组成也是不同的，有研究者认为糖脂和游离脂肪酸的富集是sEV的特征，而神经酰胺和鞘磷脂的富集则是lEV的特征［10］，另外Yang等［11］的研究也发现尿液来源的sEV与lEV的脂质组成存在差异性，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸等在sEV中比lEV中更丰富，造成上述差异的原因可能是不同EV亚类的发生方式不同。
与正常细胞来源的EV相比，肿瘤细胞来源EV携带的代谢物也存在着差异，其中研究最多的是脂质。溶血磷脂能够通过多种不同的机制参与肿瘤进展［12, 13］。目前有研究证明卵巢癌SKOV-3细胞来源的EV存在溶血磷脂酰胆碱的富集［14］，且高浓度的EV溶血磷脂酰胆碱还与乳腺癌较短
的总生存期相关［15］。但也有研究发现一些溶血磷脂如溶血磷脂酰乙醇胺在肾细胞癌患者尿液来源的EV中丰度更低［16］。另有研究发现神经酰胺和鞘磷脂也会在某些来自肿瘤细胞的EV中富集［10］，且这一现象在黑素瘤和肺癌细胞来源的EV中也得到了证实［17, 18］。此外，胆固醇酯、酵母固醇和27-羟基胆固醇等脂质的富集也曾在肿瘤来源的EV中被报道［14，19］。相对而言，肿瘤来源EV携带的其他小分子代谢物的研究还相对较少。有研究发现与非肿瘤细胞相比，来自肿瘤细胞系的EV含有更多的氨基酸及其衍生物，其中脯氨酸和琥珀酸上调最为显著，另外该研究还发现在前列腺癌细胞和T细胞淋巴瘤细胞来源的EV中能够检测到更多的叶酸和肌酐［20］。此外还有研究发现来自头颈鳞癌细胞系UMSCC47培养上清液的EV富含腺苷等嘌呤代谢产物［21］，这一现象在胰腺癌中也有报道［22］。这些肿瘤EV携带代谢物的特异性改变（图1）为其作为肿瘤诊断标志物奠定了基础。
不同肿瘤细胞来源EV的代谢物组成也发生着变化。例如，肝癌细胞系Huh7和间充质干细胞MSC来源的EV存在心磷脂的特异性富集，而脑胶质瘤细胞系U87来源的EV则被发现存在鞘磷脂的富集［10］。另外一项乳腺癌相关的研究也表明，与低转移性细胞相比，高转移性乳腺癌EV中不饱和二酰基甘油存在富集，脂质被选择性地装载到乳腺癌EV中［9］。此外，不同耐药表型［23］、不同肿瘤亚型［24, 25］以及不同分化程度［26］肿瘤细胞来源EV所携带的代谢物也存在差异，这提示EV携带的代谢物还可能在肿瘤鉴别诊断中发挥作用，且特异性的EV携带的代谢物
也许能够用于判断EV的来源。
以上研究主要探索了细胞培养液中肿瘤来源EV的代谢组学特征，值得注意的是，虽然细胞培养液来源EV相对临床样本来源EV应有更好的一致性，但是有研究发现同种细胞不同氧浓度［22］、不同pH［17］、不同培养系统［6］等条件也会引起EV代谢组学的变化，可见EV代谢组学是一个非常灵敏的指标，所以在比较不同细胞系EV携带的代谢物的过程中，也需要考虑不同培养条件对其产生的影响。综上，肿瘤来源EV的代谢组学表现出独有的特征，且能非常灵敏地反映细胞状态，有可能在肿瘤诊疗中发挥一定作用。
二、EV携带的代谢物作为肿瘤诊断标志物的价值
（一）采用EV样本进行代谢组学标志物研究的优缺点
与细胞培养液相比，血液及尿液等临床样本具有更大的异质性，但要想评价代谢物作为诊断标志物的价值，使用临床样本开展研究是非常必要的。体液样本和体液来源EV样本所富集的代谢物存在差异性［27］，目前代谢组学诊断标志物研究大多是直接采用体液样本进行分析，分离EV后再进行代谢组学研究的还相对较少。
这2种研究方案各自有其优缺点。从临床应用的难易程度上讲，直接采用体液样本更加快速便捷，而提取EV进行分析，增加了前处理过程，提高
了成本，因此临床应用难度较大。从诊断效能的优劣上来看，由于体液代谢物含量受饮食及化合物稳定性等多种因素的影响［28］，所以有囊泡膜保护的EV携带的代谢物可能是标志物研究的更好选择。EV是活细胞“主动分泌”的，其代谢物成分具有选择性，可能包含更丰富和特异的信息。此外，EV表面的许多特异性蛋白还能够用于分离肿瘤特异性的EV［29］。因此EV样本可能会提供更为同质化的代谢物来源，有利于富集肿瘤细胞的异常代谢改变，进而发现更加敏感和特异的代谢标志物。
目前已有一些研究团队对体液代谢组学和体液来源EV代谢组学的诊断效能进行了比较［18，27，30］，例如Puhka等［30］发现，与尿液相比尿液EV样本中存在特异性富集的代谢物，且尿液EV携带的代谢物的肿瘤相关改变更加明显。但由于相关报道有限，且大多纳入的样本数量较少，因此直接使用体液样本和使用体液来源的EV样本究竟孰优孰劣还有待进一步的评价。
（二）EV携带的代谢物在各系统肿瘤中的研究
1.泌尿系统肿瘤：泌尿系统肿瘤的相关研究大多采用尿液样本，其中研究最多的是前列腺癌（prostate cancer，PCa）。脂质代谢物研究方面，一项研究分析了15例PCa患者和13名健康对照者尿液EV携带的代谢物，发现9种脂类的水平存在差异，其中磷脂酰丝氨酸18∶1/18∶1和乳糖神经酰胺d18∶1/16∶0的显著性最高，将这2种脂质与磷脂酰丝氨酸18∶
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