GST表达系统的PROTOCOL
P4
自配材料：（接上）
凝血酶：将500裂解单位的冷冻干燥过的牛凝血酶(>7500 单位/毫克蛋白)0.5mL于40 o C预冷的1xPBS中。缓慢振荡使凝血酶溶解。在22o C，16h，10mM谷胱甘肽，50mMTris-HCl,pH8.0的条件下，一单位的裂解酶可裂解90％的100μg的测试融合蛋白。为保持其活性，应将凝血酶溶液分成小等份于-70o C保存（牛凝血酶分子量约为37kDa） 安全性警告及预防措施
警告：本实验器材只用于科研，不建议用于人类或动物的疾病诊断，不可用于人类或动物的体内或体外研究。
所有化学用品都有潜在毒性，只有经过实验技术训练或熟悉良好实验实践原则的人才可操作使用该产品。使用时需穿戴合适的保护服，如实验工作服、安全眼镜、手套等。使用时应小心避免化学用品接触眼和皮肤，一旦接触到则应立即用水清洗（详见材料安全使用页）。
警告：该套器材含有甲酰胺，凝胶试剂中可能含有丙烯酰胺，是一种神经毒素，并怀疑有致癌性。在合理使用过程中需要用到乙醇，是一种易燃液体，为安全操作和使用这些材料请遵循工业生产上的安全资料使用条例。
P5
自配材料：（接上）
2xYTA培养基：胰蛋白胨16g/l 酵母提取物10g/l NaCl 5g/l
将上述材料溶解于900mL蒸馏水中，用NaOH调pH致7.0后配成1升溶液。高压灭菌20分钟。介质冷却后无菌加入1mL100mg/mL的氨苄西林储存液，（使终浓度达到100μg/mL）加入12-15g琼脂以制成固体培养基。
20% Triton X –100
20% Triton X--100 ---v/v in 1x PBS
器材：用于SDS—PAGE 的试剂，仪器和凝胶
使用指导
谷胱甘肽交联琼脂糖4B用于谷胱甘肽S-转移酶、谷胱甘肽依赖的蛋白及谷胱甘肽重组衍生物，如用pGEX系列表达载体得到的谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白（GST）的快速，单步纯化。GST融合蛋白可用谷胱甘肽交联琼脂糖4B从细菌溶胞产物中直接纯化得到。蛋白质需要在温和及未失活的状态下洗脱以保持其功能和抗原性。所要的蛋白的裂解可用一特异位点蛋白酶从GST上分离得到，该蛋白的识别序列紧靠pGEX质粒的多克隆位点上游。谷胱甘肽交联琼脂糖4B（27-4574-01）可被证明在结合重组GST中是有用的。 P6
操作规程
指导：根据下述操作规程使用谷胱甘肽交联琼脂糖4B（27-4574-01）可方便地纯化少至80μg多至400mg的GST融合蛋白。
融合蛋白的产量会有很大程度的变化并受融合蛋白的性质、宿主细胞，培养条件等的影响。其产量可由1-3mg/L升至10mg/L（2）。以2.5mg/L为平均产量，表1可用来估计需要
的培养量。
注：试剂的剂量要求取决于8mg每毫升脱水凝胶的重组GST的结合能力。该结合能
力是谷胱甘肽交联琼脂糖4B（27-4574-01）的最小结合能力。要得到精确的结合能力请参考瓶上的标签。
P7
表1不同蛋白产量所需试剂的体积
组分80mg 16mg 1.6mg 80μg
培养（基）体积20L 4L 400mL 20mL
超声破碎体积1000mL 200mL 20mL 1mL
谷胱甘肽交联琼脂糖床体积* 10mL 2mL 200μL 10μL
1xPBS** 100mL 20mL 2mL 100μL
谷胱甘肽洗脱缓冲液10mL 2mL 200μL 10μL
*:为获得期望的床体积，可用由操作1中准备的50%的谷胱甘肽交联琼脂糖浆液使用两次（即1mL50%谷胱甘肽交联琼脂糖浆液为0.5床体积）
**：该体积指“每次洗脱”。需要洗脱3次
P8
①50%谷胱甘肽交联琼脂糖4B匀浆的制备
谷胱甘肽交联琼脂糖4B可用于以pGEX系列为表达载体的谷胱甘肽S-转移酶或重组GST融合蛋白产品的批量纯化或柱纯化。当凝胶平衡时，可被转移至合适的层析柱中，如果要求的话。[空的一次性PD-10柱，其Amersham Bioscience 号为17-0435-01，总容量（凝胶以及样本）约为13mL]关于谷胱甘肽S-转移酶蛋白的柱纯化细节请参照操作步骤3
1.1参照表1可根据您使用需求来决定谷胱甘肽交联琼脂糖4B的床体积。所提供的谷
胱甘肽交联琼脂糖4B约为75%的浆液。下列步骤可用于配制50%的匀浆
1.2轻轻晃动谷胱甘肽交联琼脂糖4B使凝胶重新悬浮。
1.3用吸管将足够使用量的匀浆转至合适的容器/试管中，按要求每毫升床体积配制
1.33mL原始谷胱甘肽交联琼脂糖4B匀浆。每mL干凝胶可结合至少8mg的重组GST，
要得到精确结合能力请参照瓶上标签。
P9
1.4500xg离心5分钟，使凝胶沉淀，小心倒去上层液体
1.5用10mL4℃的1xPBS（见自配材料）冲洗由每1.33mL初始谷胱甘肽交联琼脂糖
4B配制的谷胱甘肽交联琼脂糖4B，上下翻转以混匀。
注谷胱甘肽交联琼脂糖4B必须用1xPBS彻底冲洗以除去20%的乙醇贮存液。乙醇液由剩余将会影响随后的产物。
1.6500xg离心5分钟使凝胶沉淀，去上层液体。
1.7向由每1.33初始谷胱甘肽交联琼脂糖4B配制的匀浆中加入1mL1xPBS,50%的匀
浆就制成了,在随后的吸取步骤前混合均匀.
注:用1xPBS平衡的谷胱甘肽交联琼脂糖4B可在4℃存放一个约月.
P10
②批量纯化谷胱甘肽S-转移酶蛋白
2.1向每100mL超声破碎的细菌(附录3)中加入2mL用1xPBS(操作步骤1)平衡的50%
的谷胱甘肽交联琼脂糖4B匀浆.
2.2用温和的激动剂室培育30分钟
注：这一步中，吸附了混合蛋白的凝胶可填充于免洗脱柱中而易于冲洗和洗脱，如果使用免洗柱，请参考操作规程3中冲洗和洗脱的说明
2.3将混悬液500xg离心5分钟使凝胶沉淀，弃上清。
注：大部分上清液可被抛弃，但可保留部分样品用SDS-PAGE或CDNB分析鉴定（参照GST检测模型27-4590-01）以估记凝胶结合率
2.4用10倍床体积*的1xPBS洗谷胱甘肽交联琼脂糖4B小珠
2.5 500xg离心5分钟，使凝胶沉淀，弃洗液
2.6重复洗2次使洗的次数累计达到三次
注：用谷胱甘肽洗脱缓冲液可直接将结合在凝胶上的蛋白洗脱下来（参照“自配材料”）。如果需要的话，GST融合蛋白可能会裂解，裂解后的凝血酶、凝血因子Ⅹa或PreScission TM蛋白酶仍然结合在凝胶上而感兴趣的蛋白从GST上游离出来。如果pGEX 的构建中包含有凝血酶的识别序列请参照附录4。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议