广东药科大学学报
Journal of Guangdong Pharmaceutical University
Mar.2021,37(2)
收稿日期:2020⁃04⁃19
基金项目：广东省医学科学技术研究基金(A2020061)；广州市科技计划项目(201707010375） 作者简介：杨旭辉(1978-)，女，副主任技师，主要从事辅助生殖、男性精子功能研究，Email ：****************通信作者：陈柳青（1981-），女，主管技师，主要从事辅助生殖、男性精子功能研究，Email ：**************。 透明质酸受体阳性精子质量特性及对IVF⁃ET 结局影响及预测的研究 杨旭辉，吴远菲，梁嘉颖，陈柳青
（广东省妇幼保健院生殖健康与不孕症科，广东广州510080）
摘要：目的研究透明质酸（HA ）受体阳性的精子质量特性及与IVF⁃ET 受精率、正常受精率、卵裂率、
优胚率、可利用胚胎率、妊娠结局和流产的相关性研究及预测，寻评估精子功能的新指标。方法回顾性分析2017年1月-12月在广东省妇幼保健院生殖中心行体外受精（IVF ）的患者共115个取卵周期，并用固相HA 法检测精子-透明质酸结合率，分析其与精子密度、正常形态率和DNA 碎片率的相关性。进一步分析HA 受体阳性精子与IVF ⁃ET 受精率、正常受精率、卵裂率、优胚率、可利用胚胎率、妊娠结局及流产的相关性及预测价值。结果头部具有透明质酸结合位点的精子，与DNA 碎片率负相关（r =-0.198，P =0.034），与正常受精率正相关（r =0.204，P =0，029），与胚胎发育潜能均无相关性。精子-透明质酸结合率单一指标对妊娠结局及流产预测价值有限，只有联合男方年龄，DNA 碎片率才显示对妊娠结局（AUC =0.661，灵敏度83.1%、特异度54.0%）及流产（AUC =0.730，灵敏度66.7%，特异度24.5%）的较高预测价值。结论透明质酸受体阳性精子展示了低DNA 碎片率和高受精率，均有显著相关性。只有联合男方年龄和DNA 碎片率才展示对妊娠结局和流产的预测价值。 关键词：精子⁃透明质酸(HA)结合率；精子功能；受精率；正常受精率；妊娠结局中图分类号：R714
文献标识码：A
文章编号：2096⁃3653(2021)02⁃0124⁃06
DOI:10.16809/jki.2096⁃3653.2020041902
Quality characteristics of human spermatozoa with hyaluronic acid receptors and relationship with outcome of patients undergoing in vitro fertilization‑ET
YANG Xuhui,WU Yuanfei,LIANG Jiaying,CHEN Liuqing *
(Assisted Reproductive Center,Guangdong Women and Children s Hospital,Guangzhou 510010,China)*
Corresponding author Email:**************
Abstract:Objective To analyze the quality characteristics of human spermatozoa with hyaluronic acid (HA)receptors and search for a new indicator for the assessment of sperm function.Methods A total of 115cycles of in vitro fertilization (IVF)in the reproductive center of Guangdong Women and Children s Hospital from January to December 2017were retrospectively analyzed.Solid phase HA method was used to detect the sperm hyaluronic acid binding rate,and its correlation with sperm density,normal morphology rate and DNA fragmentation rate was
analyzed.The correlation and predictive value of HA receptor positive sperm with IVF⁃ET fertilization rate,normal fertilization rate,cleavage rate,excellent embryo rate,available embryo rate,pregnancy ou
tcome and abortion were further analyzed.Results Sperm with hyaluronic acid binding sites in the head was negatively correlated with DNA
fragmentation rate (P =0.034),positively correlated with normal fertilization rate (r =0.204,P =0.029),but not correlated with embryonic development potential.The single index of sperm hyaluronic acid binding rate had limited predictive value for pregnancy outcome and abortion.Only when combined with the age of the man,the DNA
第2期杨旭辉，等透明质酸受体阳性精子质量特性及对IVF⁃ET结局影响及预测的研究fragmentation rate showed higher predictive value for pregnancy outcome(AUC=0.661,sensitivity83.1%,specificity
54.0%)and abortion(AUC=0.730,sensitivity66.7%,specificity24.5%).Conclusion Hyaluronic acid receptor positive sperms show a significant correlation between low DNA fragmentation rate and high fertilization rate.Only the combination of male age and DNA fragmentation rate show predictive value for pregnancy outcome and abortion.
Key words:sperm⁃hyaluronan binding rate;sperm function;fertilization rate;normal fertilization rate;clinical pregnant rate
透明质酸(hyaluronic acid,HA)是一种长链的多糖结构，主要分布在肺、肾及生殖系统的疏松结缔组织，与透明质酸结合蛋白(hyalur onic acid binding
protein,HABP)特异性结合后与细胞外基质结合发挥作用，提高细胞外结构稳定。其对卵母细胞、精子生理活动及受精过程也发挥重要的作用。HA主要以受体HABP-配体的方式与人、兔、牛精子结合，促进精子获能、精子活力、受精能力及顶体反应。啮齿类、牛及人成熟后期的精子表面已发现透明质酸结合蛋白，而且至少2个特异的能与透明质酸结合的蛋白位点，使精子能够与卵细胞透明带结合，从而实现穿透与受精[1-4]。不成熟的精子头部缺乏HA受体，不具备与HA结合的能力。Gabor等[5]证明能与HA结合的精子成熟度高，已完成质膜重构、胞质膨出、核组蛋白与鱼精蛋白的置换等一系列过程，形成膜外HA结合位点；若成熟过程障碍则可导致精子头部HA结合位点的缺失[6]，影响精卵识别而导致受精障碍。由此可见HA精子代表一成熟度高、各项功能完备的精子。王金香等[7]研究显示，精子-透明质酸结合率<65%时，总受精率和正常受精率均显著降低，建议即使精液常规参数正常，也应谨慎选择体外受精(IVF)。Ye等[8]研究表明，精子-透明质酸结合率与精子的前向运动率和正常形态率高度相关，可进一步反映精液质量。牟万宏等[9]证实，精子-透明质酸结合率≥65%的原因不明性不孕患者的人工授精周期妊娠率高于精子-透明质酸结合率<65%的患者，提示使用与HA结合的精子实施人工授精能获得更好的结局。
精子-透明质酸结合试验(hyaluronan binding assay,HBA)作为一种简便易行的评估活动精子成熟度的功
能检测方法，但其独立或联合其他指标对于受精能力、胚胎发育潜能及流产的预测却仍存在争议。本研究通过比较HBA正常组和HBA异常组间的精液各项参数以及受精、胚胎发育及妊娠结局，探寻HBA独立或联合其他指标对IVF受精、胚胎发育及结局的预测价值，从而更好地指导临床。
1材料与方法
1.1主要试剂与仪器
WLJY⁃9000型计算机辅助精子质量分析仪(CA⁃SA)购自北京伟力；HBA、DNA碎片检测试剂盒均购自深圳市博锐德生物科技有限公司；精子形态diff⁃quick快速染试剂购自广州展成生物科技有限公司。
1.2标本来源及分组
2017年1月-12月在广东省妇幼保健院生殖中心取卵行IVF⁃ET的患者，纳入标准：①排除卵子未成熟或异常导致的受精失败；②排除女方卵巢低反应;③精液常规检查示前向运动(progressive motility, PR)精子总数≥15×106，正常形态率>1%。依照WHO 技术规范采集、处理和检测精液标本。完全液化后分别检测常规精液参数、DNA碎片、形态和以固相HA法检测透明质酸结合率。按照透明质酸临界值58%将患者分为A组(<58%)和B组(≥58%)。本研究经医院伦理委员会批准，且患者知情同意。1.3研究方法
1.3.1HBA、精液常规、正常精子形态率、DNA碎片率分析115份新鲜精液标本，以CASA检测精液常
规，HBA（精子-透明质酸结合率）按试剂盒说明书检测，在包被有透明质酸的载玻片上加入液化的精液10μL，盖上盖玻片，20~30℃条件下反应10min，显微镜20×10观察并计数500条活动精子，记录精子尾部持续鞭打但头部被结合至玻片表面活动受限(与透明质酸结合)的精子数量，计算HBA率。HBA(%)=100%×与透明质酸结合精子数/计数的活动精子总数，分析HBA结果与精子密度的相关性；以Diff⁃Quik染法染，按照WHO形态学判断标准检测精子正常形态率。精子核染质扩散法检测每份标本的精子DNA碎片水平：将含10×106/mL 精子的易熔凝胶覆盖在包被有固态凝胶的载玻片上，经变性、脱核、脱水、染处理后，显微镜下观察计数500条精子，计算存在DNA碎片的精子百分率。精子DNA碎片率(%)=100%×存在DNA碎片精子数/计数的精子总数。
1.3.2IVF⁃ET过程GnRH⁃a长方案和拮抗剂方案GnRH⁃a长方案：黄体中期，皮下注射促性腺激素释放激素激动剂醋酸曲普瑞林（达菲林）1.25mg行垂
125
广东药科大学学报第37卷
体降调节，约14d左右达到降调标准后[内膜厚度< 5mm、E2<50pg/mL，FSH(卵泡刺激素）和LH均<5U/L]，根据患者年龄、AFC（窦卵泡数）、bFSH和黄体生成素(LH)值决定肌注果纳芬/丽申宝/HMG的起始剂量，根据卵泡生长情况及E2+孕酮+LH水平调整用药。当卵泡直径≥18mm时，当晚肌注人绒
毛膜促性腺激素HCG4000~10000IU，34~36h后取卵。精卵共孵育16~18h，观察受精情况(仅2PN是正常受精)，正常受精率=正常受精卵子数/体外受精的总卵子数，受精率=总受精卵子数/体外受精的总卵子数。再次培养48h后，观察胚胎细胞数及碎片比例并评估胚胎质量，选取优质胚胎在B超引导下进行移植。优质胚胎率=大于等于6细胞优质胚胎个数/正常受精卵源的胚胎总数，可用胚胎率=大于4细胞胚胎个数/正常受精卵源的胚胎总数。拮抗剂方案：月经第2~3天测量性激素并评估卵巢基础状态，进周促排。促排期间，监测阴道B超及性激素。在卵泡直径增长至12mm以上时，加用GnRH拮抗剂。待卵泡直径大于18mm时予以绒促性素扳机，夜针后36h 取卵。
1.3.3血清激素测定月经周期第2~4天抽取空腹外周静脉血3~4mL平衡至室温后3000r/min分离血清，电化学发光法测定FSH、LH和E2。
1.3.4AFC计数月经周期第2~4天二维超声观察双侧卵巢位置、形态，记录直径为1~5mm的AFC数(重复测量2~3次)。
1.3.5统计学方法采用SPSS16.0统计软件。各组计量资料先行正态分布检验，组间计量资料比较采
用非参数Mann⁃Whitney检验(非正态)；相关性分析采用spearman(非正态)分析；利用ROC曲线及二分类logistic回归分析评价各指标的预测价值。
2结果
2.1精液常规、正常形态率、精子DNA碎片率和透明质酸结合率等相关参数的正态分布检验
用SPSS16.0软件分别对各组年龄、FSH、AMH （苗勒氏激素）、AFC计数资料进行正态分布检验，显示大部分为非正态分布。
2.2HBA与精子密度、正常形态率和DNA碎片率的关系
分别比较两组精子常规、正常形态率和DNA碎片率。结果显示，两组精子密度、DNA碎片率和正常形态率差异均无统计学意义（Z=-0.741，P= 0.459；Z=-0.306，P=0.760；Z=-0.589，P=0.556），见表1。分别对HBA、精子密度、正常形态率和DNA 碎片率进行相关性分析，结果发现仅碎片与透明质酸结合率负相关（r=-0.198，P=0.034），密度与正常形态率显著正相关（r=0.394，P=0.000）。
2.3IVF⁃ET女方的基本情况评师网
共纳入正常受精的IVF组115例，两组男方和女方的年龄、不孕年限、BMI、移植胚胎数等比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。
2.4受精及胚胎情况
共纳入正常受精的IVF组115例，两组受精率和正常受精率、卵裂率、正常卵裂率、优质胚胎率和可利用胚胎率差异均无统计学意义（P>0.05）(表3)。针对透明质酸和受精及胚胎发育进行相关性分析
组别HBA<58% HBA≥58% Z值
P值精子密度×106/mL
35.0（19.25-45.25）
32.4（23.3-56.97）
-0.741
0.459
正常形态率/%
3.65(1.90-
4.96)
3.84(1.97-
4.93)
江都市仙女镇中心小学-
0.589
0.556
DNA碎片率/%
19.0(15.7-26.3)
18.20(13.25-28.95)
-0.306
0.760
组别HBA<58% HBA≥58%
Z值
P值
女方年龄/a
33.00（30.50-38）
35（31-38）
-0.872
0.383
男方年龄/a
37（33.5-41.0）
37（32-40）
-0.013
0.990
不孕年限/年
2（1-4）
3（1-5）
-1.005
0.315
BMI/（kg·m-2）
21.6（20.15-25.20）
22.10（20.22-23.70）
-0.303
0.762
AFC/个
11（5.25-16）
9（6-13）
-
0.389
0.697
移植胚胎数/个
2(2-2)
2(2-2)
-0.089
0.929
表1两组精子密度、正常形态率和DNA碎片率的比较
Table1Levels of the sperm density,normal morphology rate and DNA fragmentation rate between two groups
表2IVF⁃ET患者基本情况
Table2Basic situation of patients in IVF⁃ET
126
第2期杨旭辉，等透明质酸受体阳性精子质量特性及对IVF⁃ET 结局影响及预测的研究
发现与正常受精率正相关（r =0.204，P =0.029）2.5与妊娠结局的相关性分析
HBA 、DNA 碎片、正常形态率、密度和男方年龄
预测临床妊娠的ROC 曲线下面积AUC1、AUC2、AUC3、AUC4、AUC5分别为0.512、0.435、0.494、0.488、0.335。仅透明质酸结合实验AUC 大于机会参考线下面积(P <0.05)，但是预测效果并不显著（图1），经过logistic 回归分析，求得HBA 、DNA 碎片和男方年龄的log(P )值，log(P )=4.000-0.099×男方年龄-0.001×透明质酸-0.001×DNA 碎片。针对该值进行早期流产的联合预测，求得ROC 曲线下面积为0.661，预测价值较为显著，其中log(P )的预测临界值0.4854，灵敏度83.1%，特异度54.0%，见图2。2.6早期流产的预测
HBA 、DNA 碎片、正常形态率、密度、男方年龄预
测早期流产的ROC 曲线下面积AUC1、AUC2、AUC3、AUC4、AUC5分别为0.482、0.580、0.592，0.610、0.725。除了透明质酸各指标的AUC 均大于机会参考线下面积(P <0.05)，但是预测效果并不显著，见图
3。经过logistic 回归分析，求得HBA 、DNA 碎片和男
方年龄的log(P )值，log(P )=-7.011+0.134×男方年龄+
0.008×透明质酸+0.022×DNA 碎片。针对该值做早
期流产的联合预测，求得ROC 曲线下面积为0.730，预测价值较为显著，其中log(P )的预测临界值0.2949，灵敏度66.7%，特异度24.5%。
组别HBA<58%HBA≥58%
Z P
受精率/%0.85（0.71-1.00）0.85（0.76-1.00）-0.2390.811
正常受精率/%0.67（0.47-0.75）0.72（0.58-0.90）-1.7300.084
卵裂率/%1.00（1.00-1.00）1.00（1.00-1.00）-0.9010.368
正常卵裂率/%0.75（0.67-1.00）1.00（1.00-1.00）-1.1660.244
优质胚胎率/%0.75（0.67-1.00）0.80（0.67-1.00）
-0.3700.711
可利用胚胎率/%1.00(0.67-1.00)
1.00（0.83-1.00）
-0.5120.609
表3IVF-ET 患者受精及胚胎发育情况比较
Table 3Fertilization and embryo development of patients in IVF⁃ET between two groups
1.00.80.60.40.20.0
透明
密度碎片形态年龄
Rredicted probability Reference Line
Source of the Curve
0.0
0.2
0.4什么是生物工程
0.6
0.8
1.0
1⁃Specificity
S e n s i t i v i t y
图1透明质酸结合实验，DNA 碎片率、正常形态率、密度和
男方年龄预测临床妊娠的ROC 曲线分析
Figure 1ROC curves of HBA,DNA fragmentation rate,normal达菲林
morphology rate,density and male age in predicting clinical pregnant rate in IVF⁃ET
1.00.8
0.60.40.20.00.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
S e n s i t i v i t y
1⁃Specificity
图2HBA 、DNA 碎片率和男方年龄联合预测临床妊娠的ROC 曲线分析Figure 2
ROC curves of HBA and DNA fragmentation rate
combined with male age in predicting clinical pregnant
rate in IVF⁃ET 1.00.80.60.40.2
0.0透明密度碎片形态年龄
Rredicted probability Reference Line
Source of the Curve
0.0
0.2
0.4
0.60.8 1.0
1⁃Specificity
怀化学院学报
S e n s i t i v i t y
图3透明质酸结合实验，DNA 碎片率、正常形态率、密度和
男方年龄预测临床早期流产的ROC 曲线分析Figure 3ROC curves of HBA,DNA fragmentation rate,nor⁃
mal morphology rate,density and male age in predicting clinical early abortion rate in IVF⁃ET
127
广东药科大学学报第37卷
3讨论
氨基甲酸乙酯辅助生殖技术的发展，对配子的功能检测要求越来越高，传统的检测方法如常规、形态、抗精子抗体等准确反映精子受精能力有限，精子受精功能相关检测相当复杂，受限于实验材料的获取、实验条件的精准控制以及结果是否准确反映在体功能，例如诱发顶体反应、精卵透明带结合实验等。因此，目前的功能检测更偏向于寻一些反映精子某项功能的相关标记物，通过检测标记物来间接反映精子某项功能。
透明质酸是人卵母细胞和透明带黏液基质的主要成分，精子在成熟的后期可获得与透明质酸特异性结合的能力，并且精子至少产生2个特异的能与透明质酸结合的蛋白位点，使精子能够与卵细胞透明带结合，从而实现穿透与受精。透明质酸结合实验就是在体外模拟这一过程，从而实现精子头部透明质酸受体的鉴定和量化，间接反映精子成熟度，是精子质量评估的新方法。这一新方法是否优于传统精液常规形态等检测指标，是否具有预测受精、胚胎发育及妊娠结局的潜能是本研究关注的问题。
本研究分两部分，一部分体外检测HBA ，对具有透明质酸受体精子的密度、正常形态率和DNA 碎片进行了检测与比对。研究结果未发现精液标本透明质酸结合率与精子正常形态率和密度的相关性，但是与碎片呈较强的负相关性。
精子形态是评价精子质量的常规指标之一，也是影响受精的重要环节。Prinosilova 等[10]研究证实
可与透明质酸结合的精子，其正常形态率比原始精液精子提高了3.04倍(95%CI :1.9-4.7)。刘瑜等[11]也持同样的观点，本研究未发现HBA 与精子正常形态率的相关性，可能有3个因素：（1）是否受所选取的样本总体有关。（2）透明质酸结合实验结果准确性受实验过程的约束，在时间的把握上有些难，稍微迟一点观察，本来已经黏附的精子就已经游离变成
阴性了，使得研究结果很难做到质控和统一。（3）这个指标单一作为筛选优质精子的特异性和敏感性还有待于进一步商榷。也有研究[12]证实HA 结合精子的形态超高倍放大后并不具有优势，可能与评估
标准不同有关。环境中的活性氧、精子生成过程中染体的异常组装、凋亡均可造成精子DNA 损伤，降低精子受精能力和胚胎发育潜能，从而降低妊娠率，使流产率增高。本研究显示：精子DNA 碎片与具有透明质酸的精子负相关，提示具有透明质酸结合位点的精子凋亡率较低。HA 与精子发育过程中的细胞凋亡、DNA 碎片化、非整倍体染体形成以及成熟度等相关性广为报道。有学者发现，能被透明质酸结合的精子，其DNA 损伤率、核蛋白苯胺蓝着率明显低于同一原始精液标本[13]，从不同角度验证了有透明质酸受体精子成熟度更好，更易耐受
氧化损伤等不良刺激。
本研究进一步收集了115例患者行IVF-ET 周期，纳入研究的两组女方平均年龄、平均不孕年限、总Gn 用量、平均Gn 使用时间等组间差异均无统计学意义。研究检测了男方精液的透明质酸结合率，将患者分为结合率正常组和结合率非正常组，比较两组的受精率、正常受精率、卵裂率、正常卵裂率、优质胚胎率、可利用胚胎和临床妊娠率是否有差异，同时将透明质酸结合率与上述指标进行相关性分析，结果并未发现两组有显著性差异，但是相关性分析发现透明质酸结合率与正常受精率正相关。由于受到精子和卵子来源的制约很难大规模推广，HBA 是用来替代精-卵透明带结合试验的检测方法，是用来评估精子结合透明带的能力，其结果与常规IVF 受精结局之间的相关性，仍存在争议。之前的研究文献[14-15]多通过比较精子-透明质酸结合率与受精率之间的相关性来证明其对于受精能力的预测价值。王金香等[7]研究显示，精子-透明质酸结合率<65%时，总受精率和正常受精率均显著降低(P <0.01)。
Ye 等[8]对175例常规IVF 周期样本研究发现HBA 结合率与体外受精率显著相关。而Nijs 等[14]研究结果显示HBA 与受精率并无相关性，但发图4透明质酸结合实验，DNA 碎片率和男方年龄联合预测
临床早期流产的ROC 曲线分析Figure 4
ROC curves of HBA,DNA fragmentation rate
combined with male age in predicting clinical early abortion rate in IVF⁃ET
1.00.8
0.60.40.20.00.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1⁃Specificity
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