TGF-β1诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质什么是经济新闻
细胞转变
复里爹
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撮
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(医学版)2..7M
ar,34FudanUnivJMedSci(2), (223)
TGF—pl诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞
血神经
向间质细胞转变
徐国萍徐璨达李海霞陈琦赵仲华刁自强许祖德
(复旦大学上海医学院病理学系上海200032)
【摘要】目的检测转化生长因子(TGF-131)能否在体外诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞一间质细胞转变(epithelial—mes—
enchymaltransition,EMT)及其相应的信号转导机制.方法在体外培养的大鼠肺泡Ⅱ型细胞(RLE一6TN)中加
入TGF-[31后，于不同时间段收取细胞，分别采用Real—timePCR及Westernblot检测上皮及间质细胞标志物表
达的改变;Westernblot检测TGF-~I对RLE一6TN细胞p-Smad2/3表达的影响;TGF-[31诱导的RLE一6TN细胞
形态学的改变采用倒置相差显微镜观察，超微结构的改变采用透射电子显微镜观察.结果加入TGF-~I到 RLE-6TN细胞后，其间质细胞标志物表达上调，上皮细胞标志物的表达下调}加入TGF-[31到RLE一6TN细胞
后，其p-Smad2/3的表达明显上调；形态学上,TGF-[31诱导RLE-6TN细胞向成肌纤维细胞样细胞转变；超微结
fgf构上,TGF-[31诱导RLE-6TN细胞特有的嗜锇性板层小体发生变性，肿胀并随
TGF-~81作用时间延长最终完全
消失.结论TGF-~81能在体外诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转变，其机制部分与Smad信号转导途径
相关.
【关键词】转化生长因子81；肺泡Ⅱ型上皮细胞；上皮细胞一间质细胞转变
【中圈分类号】R322.35【文献标识码】A
Epithelial—mesenchymal
epithelialcells
transitionoftypeIIalveolar
inducedbyTGF-pl
XUGuo-ping,XUJing-da,LIHai—xia,CHENQi,ZHAOZhong-hua,DIAOZi—qiang,XUZu—deA
(DepartmentofPathology,ShahghaiMedicalCollege,FudanUniversity,Shanghai200032, China)
[Abstract]PurposeTheaimofthepresentstudywastoinvestigatewhetherornottransforming growthfactor一口1(TGF-[31)couldinduceepithelial—mesenchymaltransition(EMT)oftypeIIalveolar
epithelialcells(RLE一6TN)invitroanditspossiblemechanism.MethodsAftertheinvitrocultured
pressionofthemarkers ofepithe—lialcellandmesenchymalcellwasassayedusingWesternblotandReal—timePCRanalysis.Western
blotwasalsousedtodetecttheeffectofTGF-131onthep-Smad2/3expressionofRLE-6TNce lls.
Morphologicalalterationswereexaminedbyphase-contrastmicroscope,andultrastructure changesby
electronmicroscope.ResultsIncubationofRLE一6TNcellswithTGF-131(3ng/mL)resultedinthe
氟苯尼考琥珀酸钠up-regulationoftheexpressionofthemesenchymocytemarkersandthedownregulationofth
eepitheli—
almarkers.Meanwhile,incubationofRLE一6TNcellswithTGF-~Icouldalsoleadtotheapparentup_ regulati
onoftheexpressionofp-Smad2/3andthetransitionofRLE一6TNcellstomyofibroblast-like
cellsmorphologically.Inuhrastructure,TGF-~Iexposureresultedinthedisappearanceofthe osmio—
philicmultilamellarbodiesspecifictoRLE一6TNcells.ConclusionsTGF-131caninduceEMTof
RLE一6TNcellsinvitro,andthemechanismispartiallyrelatedtoSmadsignaltransductionpathway. [Keywords]transforminggrowthfactor(TGF)一口1;type11Alveolarepithelialcell;epithelial—mes—
enchymaltransition(EMT)
△通讯作者E-mail:*****************
224复旦(医学版)2007年3月,34(2)
近年研究发现肺纤维化病灶内增生的肌成纤维
细胞(myofibroblast,MFb)除来源于肺内固有的间
充质细胞外，还可能来源于外周血(骨髓源性)u].
新近有文献报道[2]，纤维化病灶内肺泡Ⅱ型上皮细
胞可能通过上皮细胞向问质细胞转变(epithelial—mesenchymaltransition,EMT)而成为MFb的部分
来源.
研究发现，转化生长因子～/31(transforming
growthfactor,TGF一/31)在EMT的过程中起着重要
的作用.Smad(Sma/MothersAgainstDecapenta—
plegic)蛋白是TGF-/31细胞内信号转导过程中一个
极其重要的介导分子.TGF-/31与其受体结合后,
可激活受体性Smad2和Smad3，进而与共同通路
性Smad4形成三聚体并转位到核内，上调一些与EMT相关基因的表达[3].本实验采用Western
blot,Real—timePCR，倒置相差显微镜和透射电镜
观察TGF-/31对体外培养的大鼠肺泡RLE-6TN细
胞的上皮及间质细胞标志物表达的影响，为进一步
阐明TGF一81/Smad信号通路在肺纤维化发生中的作用，并为开展对肺纤维化动物模型的提供理
论和实验依据.
材料和方法
试剂及物品3-actin鼠抗人一抗,a—SMA小鼠
抗人一抗购自Sigma公司;E—cad羊抗人一抗购自BD公司,FN兔抗鼠一抗,Vimentin小鼠抗人一抗 购自长岛公司,p-Smad2兔抗人一抗购自Chemi-
con公司,Z1,SP-A,CTGF羊抗人一抗,CD147
羊抗人一抗均购自SantaCruz，羊抗鼠，羊抗兔，驴
抗羊二抗IRDyeConjugates购自LI-CORBiosci- ences.辣根过氧化物酶标记的驴抗羊二抗购自上
海鼎国生物有限公司.
细胞培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-
6TN细胞购自美国ATCC，细胞在37℃,5Co,
饱和湿度的条件下用含10胎牛血清(PAA公司)
的DMEM/Ham,sF12(1:1)(GIBCO公司)培养基
培养.
旋转机械故障诊断相差显微镜观察当细胞生长融合至60～
80时，弃培液，换含0.5胎牛血清的DMEM/
F12培液静止48h，换新鲜静止液，于培液中加入
TGF一81(3ng/mL)(如无特殊，均用此剂量)(R&D 公司)作用48h后，使用倒置相差显微镜观察细胞
形态学的改变并拍照.以不加TGF～/31组做阴性对照.
电子显微镜观察当细胞生长融合至60～
80时，弃培液，换含0.59/6胎牛血清的DMEM/
F12培液静止48h，换新鲜静止液，于培液中加入TGF-/31，分别于12,24,48和72h刮下细胞,1500 r/min,4℃离心5min，弃上清后，加入新鲜配制的2.5戊二醛，送电镜室经1%锇酸固定，树脂包埋
等制样，超切后用透射电镜(电镜型号:HITAcHI一700)观察并拍照.以不加TGF-/31组做阴性对照. 总RNA抽提及逆转录反应当细胞生长融合
至60～80时，弃培液，换含0.5胎牛血清的DMEM/F12培液静止48h，换新鲜静止液，于培液中加入TGF-/31，分别于0,1,3,6,12和24h于10 cm细胞培养皿中加入1.0mLTRIzolReagent，按
其说明书操作步骤提取总RNA，电泳证实，具有清晰18S和28S条带的RNA用于逆转录实验.利
用Invitrogen公司逆转录试剂盒合成cDNA，具体操作按试剂盒说明书中的建议进行.cDNA产物于一
20℃保存.
实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(Real-time PCR)实时定量试剂盒PlatinumSYBRGreen qPCRSuperMixUDG购买于Invitrogen公司，加
样体系按试剂盒说明书操作.实时定量PCR仪为Rotor—Gene公司的RG-3000，反应条件:95℃10 min；在95℃30S,55℃30S(不同引物见表1),李福兆
72℃30S,40个循环；由随机附带软件Rotorgene 计算ct值和拷贝数.引物由上海生工公司合成.
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