人骨髓间充质干细胞体外成骨与成脂分化过程中FGF1及其受体表达的变化 董平;焦虎;李秋晨;吕晓岩;尹艳花;肖苒
【摘 要】Objective To study the dynamic expression profiles of fibroblast growth factor 1 (FGF1) and its receptors (FGFRs) during osteogenic and adipogenic differentiation of human bone marrow stromal cells (hBMSCs),and further exploring the role of FGF1 during hBMSCs differentiation.Methods Cells were isolated from human bone marrow by density gradient centrifugation method.hBMSCs in the 3rd passage were induced into osteoblasts and adipocytes respectively,and followed by staining for identification.The expressions of FGF1,FGFRs,and marker genes during osteogenic and adipogenic differentiation,were detected by real-time PCR.Immunofluorescent staining was applied for FGF1 localization of hBMSCs after induced differentiation.Meanwhile,the influence of exogenous FGF1 on osteogenic and adipogenic differentiation was detected by real-time PCR and Oil Red O stainning.Results Osteogenic and adipogenic induced hBMSCs were stained by Alizarin Red S and Oil Red O.The expression status of FGF1 and its receptors showed dynamic var
iation.Immunofluorescent staining results illustrated that FGF1 was mainly distributed in cytoplasm,and its expression amount increased in nucleus after osteogenic induction for 3 days.The expression of osteopontin increased during osteogenic differentiation in the presence of exogenous FGF1 for 3 days (P ＜0.05),and the amount of lipid droplet decreased and the expressions of adipogenic marker genes were suppressed during adipogenic differentiation after the introduction of exogenous FGF1 for 7 days (P ＜0.01).Conclusions FGF1 may inhibit adipogenic differentiation of hBMSCs,and promotes the expression of OPN,which may further hasten the maturity of osteogenesis.%目的 研究人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨与成脂分化过程中成纤维细胞生长因子1(FGF1)及其受体(FGFRs)的动态表达,探讨FGF1在hBMSCs成骨与成脂分化过程中的作用.方法 密度梯度离心法分离hBMSCs,取第3代细胞分别进行成骨和成脂诱导分化并染鉴定.通过real-time PCR方法检测成骨和成脂标志基因以及FGF1/FGFRs的表达,免疫荧光染法检测诱导分化前后FGF1的表达.Real-time PCR及油红O染鉴定外源性FGF1对hBMSCs成骨与成脂分化的影响.结果 体外诱导hBMSCs成骨和成脂分化后茜素红和油红O染结果呈阳性；FGF1和FGFRs在诱导过程中呈动态表达；免疫荧光染结果表明FGF1主要在细胞质中分 布,成骨诱导3d后在细胞核中的表达增加；相比对照组,加入外源的FGF1组7d后脂滴数量明显减少,成脂标志基因表达受到抑制(P＜0.01),而加入外源的FGF1 3 d骨桥蛋白(OPN)表达升高(P＜0.05).结论 FGF1能够抑制hBMSCs的成脂分化,并且可能通过促进骨桥蛋白表达而提前hBMSCs的成骨矿化.
【期刊名称】《基础医学与临床》
【年(卷),期】2013(033)008
【总页数】6页(P941-946)
【关键词】fgf骨髓间充质干细胞;成骨分化;成脂分化;FGF1;FGFRs
【作 者】董平;焦虎;李秋晨;吕晓岩;尹艳花;肖苒
谋杀章鱼保罗【作者单位】中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院研究中心,北京100144;中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院研究中心,北京100144;中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院研究中心,北京100144;中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院研
究中心,北京100144;中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院研究中心,北京100144;中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院研究中心,北京100144
恩丹西酮【正文语种】中 文
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【中图分类】Q254
人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)因具有自我更新和多向分化能力而被广泛应用于组织工程与再生医学，对hBMSCs多向分化能力的调控是其临床应用的基础。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)及其受体(fibroblast growth factor receptor，FGFR)是调控成骨与成脂发生的重要分子［1-2］，然而它们在hBMSCs成骨与成脂分化过程中的动态表达及其作用机制并不清楚。本实验就hBMSCs在成骨与成脂分化过程中FGF1及其受体mRNA的动态表达进行系统研究，并进一步探讨外源性FGF1对于hBMSCs成骨与成脂分化的影响。
1 材料与方法
1.1 试剂
DMEM和青霉素-链霉素(HyClone公司);PBS(Sigma公司);胎牛血清和0.25%胰蛋白酶(Gibco公司);M-MLV反转录酶(Invitrogen公司);dNTP和oligodT(Promige公司);引物合成(北京赛百盛);SYBER Green Master Mix(Roche公司);小鼠抗人FGF1抗体(sc-101145)、(Santa Cruz公司);Alexa Fluor® 594驴抗小鼠IgG(A21203)(Invitrogen公司);重组人FGF1(北京义翘神州)。
1.2 hBMSCs的分离纯化和扩增水下皇陵
取健康志愿者(年轻男性，知情同意)髂骨骨髓血，密度梯度离心，取中间云雾层细胞接种培养并记为P0代细胞。接种后7～10 d，用胰蛋白酶消化传代纯化并扩增。
1.3 hBMSCs的定向诱导和鉴定
将P3代hBMSCs接种至6孔板，待细胞90%～95%汇合更换诱导分化培养基，此时记为第0天。成骨诱导(Os:低糖完全培养基+0.01 μmol/L地塞米松 +10 mmol/L β-甘油磷酸钠 +50 μmol/L抗坏血酸)21 d后细胞进行茜素红染、成脂诱导(AM:低糖完全培养基+0.5 mmol/L异丁基甲基黄嘌+1 μmol/L地塞米松 +200 μmol/L吲哚美辛 +10 μmol/L胰岛素)10 d细胞进
行油红O染并在不同时间点real-time PCR检测相关标志基因。分别加入终浓度为 10和25 μg/L外源性 FGF1和20 000 U/L肝素的成脂诱导液诱导7 d后油红O染并real-time PCR检测成脂标志基因表达。含相同浓度FGF1和肝素的成骨诱导液诱导3 d后检测成骨标志基因表达。
hBMSCs成骨分化鉴定:37℃用0.1%茜素红-Tris-HCl染液染30 min，蒸馏水冲洗后镜下观察。
hBMSCs成脂分化鉴定:室温用油红O染液染30 min，蒸馏水冲洗5 min，镜下观察。
1.4 Real-time PCR
根据Trizol试剂说明书提取细胞总 RNA，取500 ng总RNA进行反转录反应，然后real-time PCR检测相关基因表达水平。引物序列为:FGF1上游5'-TACAAGAAGCCCAAACTCCTC-3'，下游 5'-ATTTGGT GTCTGTGAGCCGT-3';FGFR1上游5'-ACCACCGACA AAGAGATGGA-3'，下游 5'-GCAGAGTGATGGGAGA GTCC-3';FGFR2IIIb上游5'-TCTGCCTGGCTCACTGTC-3'，下 游 5'-CTTGGTCGTGTTCTTCATTCG-3';FGFR2IIIc上
游5'-GCTTGGCGGGTAATTCTATTG-3'，下 游 5'-CTTGGTCGTGTTCTTCATTCG-3';FGFR3IIIb上游 5'-AGGATGAACAGGAAGAAGCC-3'，下 游 5'-TCTG TCGAGCCACCAATTTC-3';FGFR3IIIc上游5'-CACC CTACGTTACCGTGCTCAA-3'，下游 5'-AGCCACGCA GAGTGATGAGAA-3';FGFR4上游5'-TGACTCCTTAC CTCCAGCA-3'，下 游 5'-ATGCCTCCAATGCGGTTCTC-3';RUNX2上游 5'-ACTGGCGCTGCAACAAGAC-3'，下 游 5'-CCCGCCATGACAGTAACCA-3';PPARγ上游5'-TGGAATTAGATGACAGCGACTTGG-3'，下 游 5'-CTGG AGCAGCTTGGCAAACA-3';GAPDH上游 5'-GCACC GTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游5'-TGGTGAAGACGCC AGTGGA-3'。
1.5 免疫荧光染
分别取hBMSCs诱导前和诱导3 d的细胞爬片，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%Triton X-100透化5 min，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1.5 h，DAPI染细胞核，荧光显微镜下观察并采集图像。
1.6 统计学分析
取3组实验数据结果以均值±标准差(±s)表示，采用SPSS16.0进行数据分析处理，基因的相对表达量采用2-ΔΔCT方法，GAPDH 作为管家基因，组间差异比较用t检验。
2 结果
2.1 hBMSCs成骨、成脂诱导分化及鉴定
hBMSCs成骨诱导21 d发现明显的矿物质沉积，茜素红染可见红的矿化结节，成骨标志基因RUNX2表达升高(P＜0.01)，第7天到达峰值(图1A，B，C);hBMSCs成脂诱导10 d镜下细胞中可见明显脂滴，经油红O染脂滴呈红，成脂标志基因PPARγ表达显著增强(P＜0.01)(图1D，E，F)。
2.2 hBMSCs成骨、成脂分化过程中FGF1的动态表达
京津陆海运河FGF1 mRNA在hBMSCs成骨诱导后1～3 d表达升高(P＜0.05)，之后逐渐恢复到诱导前水平;而FGF1在hBMSCs成脂诱导后1～5 d表达显著下降(P＜0.01)(图2A)。免疫荧光染显示FGF1在hBMSCs中的表达有明显核质差异，主要在细胞质表达，成骨诱导3 d后核质差异减小，成脂诱导中FGF1蛋白表达明显减少(图2B，C，D)。
2.3 hBMSCs成骨、成脂分化过程中FGFRs的动态表达
FGFR1、FGFR2IIIb、FGFR2IIIc和 FGFR4 mRNA在hBMSCs成骨、成脂分化中呈现相同的表达趋势，并且在表达最高点与诱导前相比显著增强(P＜0.01)(图3A，B，C，F)。FGFR1 在成骨诱导中达到峰值的时间较成脂诱导晚(图3A);FGFR2IIIc和FGFR4在成脂诱导过程中表达始终高于诱导前(P＜0.05)，但在成骨诱导14 d表达显著低于诱导前(P ＜0.01)(图 3B，C，F);FGFR3IIIb和 FGFR3IIIc从诱导1 d起表达较诱导前显著降低(P＜0.01)，并且成脂诱导时下降较成骨诱导迅速(图3D，E)。
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