闫文娟;李轶;王山梅;孙明洁
【摘 要】Objective To investigate the drug resistance characteristics and mechanism of carbapenem-resistant Escherichia coli in Henan Provincial People's Hospital. Methods The identification and antimicrobial susceptibility in vitro of the isolates from qualified clinical specimens were analyzed by BD Phoenix 100 microorganism analysis system. The isolates of carbapenem-resistant Escherichia coli were screened according to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) standard. Modified Hodges test and meropenem(MEM)-ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)-Na2 double-disk synergy test were used for phenotypic screening of the isolates. By polymerase chain reaction(PCR),the resistance genes,blaKPC,blaNDM,blaVIM,blaIMP and blaOXA-48,in the isolates were detected. The transferability of blaKPC in the blaKPC-positive isolates was studied by conjugation test. Results A total of 8 carbapenem-resistant Escherichia coli were screened from the 1 238 isolates. In the 8 isolates,7 isolates were resistant to imipenem (IPM)and M
EM,but 1 isolate was only resistant to MEM. All the 8 isolates were positive in the modified Hodges test, and 6 isolates were positive in the MEM-EDTA double-disk synergy test. There were 2 isolates carrying blaKPC-2 and 3 isolates carrying blaIMP-4. Conjugation test indicated that blaKPC-2 could be transferred to Escherichia coli. Conclusions Carbapenem-resistant Escherichia coli carrying blaIMP-4 is firstly reported in the hospital. The resistance mechanism of carbapenem-resistant Escherichia coli in the hospital is mainly carrying blaKPC-2 and blaIMP-4,and the blaKPC-2 gene could be horizontally transmitted by plasmid.%目的：了解河南省人民医院耐碳青霉烯类抗菌药物大肠埃希菌的耐药特点和耐药机制。方法收集临床送检合格样本分离到的细菌，采用BD Phoenix 100微生物分析系统进行细菌鉴定及体外药物敏感性分析，依照美国临床实验室标准化协会（CLSI）标准筛选出耐碳青霉烯类大肠埃希菌。采用改良Hodges和美罗培南（MEM）-乙二胺四乙酸（EDTA）-Na2双纸片协同试验进行表型筛选。聚合酶链反应（PCR）检测耐药基因blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48。对blaKPC阳性菌株进行接合转移试验。结果从1238株大肠埃希菌中筛选到8株耐碳青霉烯类菌株，7株对亚胺培南（IPM）、MEM均耐药，有1株仅对MEM耐药。8株改良Hodges试验均为阳性，6 株双纸片协同试验阳性。2株携带blaKPC-2，3株携带blaIMP-4。blaKPC-2可以发生接合转移。结论首次在河南省人民医院发现产blaIMP-4的大肠埃希菌，其耐碳青霉烯类抗菌药物的机制主要为携带blaKPC-2和blaIMP-4，blaKPC-2基因可以通过质粒水平传播。
ndm【期刊名称】《检验医学》
【年(卷),期】2016(000)001
【总页数】5页(P56-60)
【关键词】大肠埃希菌;碳青霉烯酶;耐药机制
【作 者】闫文娟;李轶;王山梅;孙明洁
【作者单位】河南省人民医院检验科，河南 郑州 450003;河南省人民医院检验科，河南 郑州 450003;河南省人民医院检验科，河南 郑州 450003;河南省人民医院医院感染管理科，河南 郑州 450003
【正文语种】中 文
【中图分类】R378.2
近年来，对碳青霉烯类抗菌药物耐药的细菌不断出现，由于其往往对几乎所有的抗菌药物耐药而越来越受到关注。在导致细菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的机制中产碳青霉烯酶是常见的机制[1]。碳青霉烯酶主要包括Ambler分类中的A、B和D 3个类型。临床最常见也最为重要的为A类KPC型碳青霉烯酶，其活性可被硼酸抑制。B类碳青霉烯酶具有最强的碳青霉烯水解活性，可被乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抑制，主要有IMP型、VIP型和NDM型等。D类主要是OXA型碳青霉烯酶[2]。KPC型碳青霉烯酶和OXA型碳青霉烯酶分别最常在克雷伯菌属和不动杆菌属细菌中被检测到[3]。目前，国内很多学者报道了产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌[4-5]。河南省郑州地区之前也报道了产KPC-2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌和日沟维肠杆菌[6]，但有关碳青霉烯类抗菌药物耐药大肠埃希菌的研究报道较少。我们针对河南省人民医院临床分离的碳青霉烯类抗菌药物耐药大肠埃希菌的耐药分子机制进行了分析。
一、菌株来源
在医院睡了夜班护士收集2011年6月至2012年12月河南省人民医院住院患者痰、尿、血等临床样本分离的大肠
埃希菌共1 238株，其中筛选到耐碳青霉烯类菌株8株，所有细菌均经BD phoenix100微生物分析系统（美国BD公司）鉴定。
二、主要试剂与仪器
亚胺培南（imipenem，IPM）、美罗培南（meropenem，MEM）纸片购自Oxoid公司，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂购自加拿大Fermentas公司，引物合成由赛百盛公司完成，测序由北京三博远志生物技术公司完成。
三、药物敏感性试验
用BD phonenix 100微生物分析系统鉴定并检测细菌对各种抗菌药物的敏感性。初步筛选出对IPM或MEM耐药菌株，再通过微量肉汤稀释法检测细菌对IPM、MEM的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC），折点的判定依据美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） M100-S23标准[7]。质控菌株：大肠埃希菌（ATCC 25922）。
四、碳青霉烯酶表型检测及MEM-EDTANa2协同试验
依据CLSI M100-S23进行改良Hodges试验，产KPC阳性对照株由上海交通大学附属第六人民医院汤瑾教授馈赠。
配制0.1 mol/L EDTA-Na2，加10 μL至MEM纸片上，无菌条件下自然干燥备用。将待测菌配制成0.5麦氏浊度的菌悬液，均匀涂布于水解酪蛋白胨药物敏感性板，将MEM和MEM-EDTANa2的纸片贴于琼脂表面，间距约为25 mm，35 ℃孵育过夜。结果判定：含酶抑制剂合剂与单药的抑菌圈直径相差≥5 mm，提示该菌产生金属β-内酰胺酶[8]。
五、基因检测
王世尧加热煮沸法制备DNA模板，PCR检测常见碳青霉烯耐药基因，包括blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP和blaOXA-48。反应体系依照Fermentas公司推荐条件进行。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，Goldview 1型染剂染后观察结果。所用引物见表1。
六、接合转移试验
供体菌为产KPC型酶的大肠埃希菌，受体菌为利福平耐药的大肠埃希菌C600。挑取供体菌和受体菌单个菌落分别接种于水解酪蛋白胨肉汤，35 ℃震荡培养4 h，供体菌和受体菌以1
0∶1的比例加入新鲜水解酪蛋白胨肉汤，孵育过夜，取100 μL铺于含100 mg/L利福平和4 mg/L IPM的水解酪蛋白胨平板，对转移接合子进行KPC型碳青霉烯酶的PCR和测序鉴定。
辽宁五点一线一、药物敏感性试验
MIC检测结果显示，8株耐药菌株对MEM 的MIC值均>32 μg/mL。除菌株ECO5和ECO8对IPM的MIC值分别为8和2 μg/mL外，其他细菌对IPM的MIC值均>32 μg/mL。见表2。
二、碳青霉烯酶表型筛选
8株耐药菌株的改良Hodges试验结果均为阳性，在MEM和MEM-EDTA-Na2双纸片协同试验中，除菌株ECO1和ECO2为阴性外，其余6株菌株均为阳性。见表2、图1。
亟待解决
三、PCR对耐药基因的检测和接合转移试验
PCR和测序结果显示菌株ECO1和ECO2携带有blaKPC-2基因，见表2、图2，而菌株ECO5、ECO6和ECO8携带有blaIMP-4基因，见图3。没有检测到blaNDM、blaOXA-48和blaVIM基因。
国际海事组织
对blaKPC-2阳性的菌株ECO1和ECO2进行接合转移试验。菌株ECO1成功获得接合子，PCR扩增blaKPC基因，与供体菌完全一致，见图4。说明blaKPC基因可以水平转移。大肠埃希菌C600对 MEM和IPM的MIC值分别为0.125和0.5 μg/mL，而菌株ECO1接合子对MEM和IPM的MIC值分别为16和8 μg/mL。菌株ECO2经反复多次试验未获得接合子。
大肠埃希菌是临床上常见的条件致病菌，由于碳青霉烯类抗菌药物的广泛使用，对碳青霉烯类抗菌药物耐药的大肠埃希菌越来越常见。
本研究结果显示所筛选到的8株耐碳青霉烯类抗菌药物菌株中，有7株对IPM和MEM均耐药，1株对IPM敏感。这可能是由于虽然IPM和MEM都属于碳青霉烯类抗菌药物，作用机制类似，但在耐药机制上有一定的差异。而且细菌产生超广谱β-内酰胺酶或AmpC酶，同时合并外膜蛋白丢失等机制都会影响细菌对碳青霉烯类抗菌药物的敏感性[12]，本研究中是否存在合并外膜蛋白丢失的机制有待进一步研究。也有研究发现质粒编码的金属β-内酰胺酶（IMP-6）与碳青霉烯类（尤其是MEM）的耐药性有关，产IMP-6金属酶菌株对MEM的MIC值高于对IPM的MIC值[13]。本研究发现菌株ECO5、ECO6和ECO8携带有blaIMP-4，但3株菌株对IPM的敏感性各不相同，因此blaIMP-4与MEM和IPM的MIC值是否有相关性，具体的耐药机制有待进一步研究。
本研究中8株耐药菌的改良Hodges试验均为阳性，菌株ECO1和ECO2的MEM和MEMEDTA-Na2双纸片协同试验为阴性，表示这2株菌株可能不携带金属酶，后续的PCR检测发现这2株菌株携带blaKPC-2基因。协同试验阳性菌株ECO3、ECO4和ECO7未检测到常见的耐药基因blaIMP、blaNDM、blaOXA-48和blaVIM，推测其耐碳青霉烯类抗菌药物的机制可能是产其他的金属酶，亦有可能存在新的金属酶基因，或合并有外膜蛋白缺失或外膜通透性下降等其他机制[14]。菌株ECO1的接合转移试验证实blaKPC基因可以水平转移，说明该基因存在于质粒上。在所有耐药菌株中未检测到blaNDM、blaOXA-48和blaVIM。
本研究结果显示耐碳青霉烯类抗菌药物大肠埃希菌携带有blaIMP-4基因，为河南省人民医院首次发现。耐碳青霉烯类抗菌药物大肠埃希菌也携带有blaKPC-2基因，该基因可以通过质粒水平传播。因此，该院分离到的大肠埃希菌中的碳青霉烯酶以KPC-2和IMP-4型的流行为主，应该加强耐碳青霉烯类细菌的监测，以减少其播散和传播。
【相关文献】
[1]CHEN YT，LIN JC，FUNG CP，et al.KPC-2-encoding plasmids from Escherichia coli
and Klebsiella pneumoniae in Taiwan[J]. J Antimicrob Chemother，2014，69（3）： 628-631.
[2]NORDMANN P，NAAS T，POIREL L. Global spread of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae[J]. Emerg Infect Dis，2011，17 （10）： 1791-1798.
[3]CHMELNITSKY I，SHKLYAR M，HERMESH O，et al. Unique genes identified in the epidemic extremely drug-resistant KPC-producing Klebsiella pneumoniae sequence type 258[J]. J Antimicrob Chemother，2013，68（1）： 74-83.
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