㊃论著㊃
DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2016.09.010作者单位:300192天津市第一中心医院检验科通信作者：穆红，:tjmuhong@sina
刘萍㊀张坚磊㊀刘晔华㊀穆红
㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀研究耐碳青霉烯类抗菌药物的肺炎克雷伯菌的耐药基因和基因分型㊂方法
回顾性研究㊂收集2012年4月至2015年4月天津第一中心医院临床分离的碳青霉烯类药物不敏感的肺炎克雷伯菌52株㊂采用微量稀释法进行常规药敏试验，使用改良Hodge 试验确证碳青霉烯酶的表型㊂采用多重PCR 技术检测菌株携带的耐药基因，多位点序列分型(MLST)分型技术对肺炎克雷伯菌进行分型㊂结果㊀药敏试验显示所有菌株具有多重耐药，对哌拉西林/舒巴坦㊁头孢曲松㊁头孢他啶㊁头孢吡肟㊁氨曲南㊁亚胺培南㊁美罗培南全部耐药，耐药率100%(52/52),ST11型肺炎克雷伯菌对阿米卡星耐药率为93．5%(43/46)，对环丙沙星的耐药率为97．8%(45/46)，对左氧氟沙星的耐药率为97．8%(45/46)，对复方磺胺甲
唑的耐药率为17．4%(8/46)，对替加环素的耐药率为0㊂ST101
型肺炎克雷伯菌对阿米卡星耐药率为3/3，对环丙沙星的耐药率为2/3，对左氧氟沙星的耐药率为3/3，对复方磺胺甲唑的耐药率为3/3，对替加环素的耐药率为0㊂ST709型肺炎克雷伯菌对阿米卡星耐药率为1/1，对环丙沙星的耐药率为1/1，对左氧氟沙星的耐药率为1/1，对复方磺胺甲唑的耐药
率为1/1，对替加环素的耐药率为0㊂ST1393型肺炎克雷伯菌对阿米卡星耐药率为1/1，对环丙沙星
的耐药率为1/1，对左氧氟沙星的耐药率为1/1，对复方磺胺甲
唑的耐药率为1/1，对替加环素的耐
药率为0㊂ST2068型肺炎克雷伯菌对阿米卡星耐药率为1/1，对环丙沙星的耐药率为1/1，对左氧氟沙星的耐药率为1/1，对复方磺胺甲唑的耐药率为1/1，对替加环素的耐药率为0㊂PCR 检出46株产KPC-2型耐药基因菌株,5株OXA-48型菌株,1株DNM-1型菌株㊂MLST 分型ST11型是主要型别，共46株，均为碳青霉烯酶KPC-2型，产NDM-1型碳青霉烯酶的菌株MLST 分型为ST2068型，产OXA-48型的5株菌MLST 分型中3株为ST101型,1株为ST709型,1株为ST1393型㊂结论㊀本院耐碳青霉烯类抗菌药物的肺炎克雷伯菌的耐药基因为KPC-2型，另外有散在OXA-48和NDM-1型;
MLST 分型主要为ST11，为我院感染及防控病原菌的传播提供了切实有效的依据和参考㊂(中华检验医学杂志,2016,39:701-704)ʌ关键词ɔ㊀肺炎克雷伯菌;㊀卡巴配能类;㊀抗药性，细菌;㊀细菌蛋白质类;㊀β内酰胺酶类；多位点测序分型
基金项目：国家临床重点专科建设项目(检验专业)(2013-544)
Research on drug resistant genes and genotypes of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae Liu Ping ,Zhang Jianlei ,Liu Yehua ,Mu Hong．The Clinical Laboratory Department ,Tianjin First Center Hospital ,Tianjin 300192,China
Corresponding author :Mu Hong ,Email :tjmuhong@sina．com
ʌAbstract ɔ㊀Objective ㊀To investigate the drug resistant genes and genotypes of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in Tianjin First Center Hospital．Methods ㊀A total of 52strains of carbapenem-non-susceptible Klebsiella pneumoniae were collected from 2012to 2015．The MICs of antimicrobial drugs were detected using agar dilution methods．Phenotypes of carbapenemases were screened using modified Hodge test．Drug resistant genes were detected by multiplex-PCR assay．Multilocus sequence typing (MLST)was used to determine the genotypes and homology of these carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains．Results ㊀Susceptibility of antimicrobial agents indicated that all these strains with multiple drug resistance．The resistance rate to piperacillin /tazobactam,ceftriaxone,ceftazidime,cefepime,aztreonam imipenem,meropenem was 100%(52/52)．The resistance rate of ST11type to amikacin was 93．5%(43/
46),ciprofloxacin was97．8%(45/46),levofloxacin was97．8%(45/46),compound sulfamethoxazole was 17．4%(8/46),tigecycline was0．The resistance rate of ST101type to amikacin was3/3,ciprofloxacin was 2/3,levofloxacin was3/3,compound sulfamethoxazole was3/3,tigecycline was0．The resistance rate of ST709type to amikacin was1/1,ciprofloxacin was1/1,levofloxacin was1/1,compound sulfamethoxazole was1/1,tigecycline was0．The resistance rate of ST1393type to amikacin was1/1,ciprofloxacin was1/1, levofloxacin was1/1,compound sulfamethoxazole was1/1,tigecycline was0．The resistance rate of ST2068 type to amikacin was1/1,ciprofloxacin was1/1,levofloxacin was1/1,compound sulfamethoxazole was1/ 1,tigecycline was0．PCR results showed that43isolates were bla KPC-2positive and5isolates were bla OXA-48 positive,1isolate was bla DNM-1positive．There were46strains of ST11type．The43strains of Klebsiella pneumoniae producing KPC-2type carbapenemase were all ST11．While among5strains of Klebsiella pneumoniae carrying OXA-48carbapenem resistant gene,3strains were ST101,1was ST709,1was ST1393．One strain of Klebsiella pneumoniae harboring DNM-1type carbapenemase was ST2068．Conclusions㊀Drug resistant genes of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae were KPC-2 dominant,OXA-48and DNM-1were sporadical;the genotype was mainly ST11by MLST in the hospital．The research provided effective basic and reference for the hospital infection t control．(Chin J Lab Med,2016, 39:701-704)
ʌKey wordsɔ㊀Klebsiella pneumoniae;㊀Carbapenems;㊀Drug resistance,bacterial;㊀Bacterial proteins;㊀beta-Lactamases;㊀Multilocus sequence typing
Fund program:National Key Clinical Specialist Construction Programs of China(Laboratory Specialty)(2013-544)
㊀㊀近年来由于碳青霉烯类抗菌药物的广泛使用，导致耐碳青霉烯类抗菌药物的肺炎克雷伯菌株迅速蔓延㊂碳青霉烯酶的产生是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要原因㊂本研究对采用多重PCR和多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)分型技术对52株耐碳青霉烯类抗菌药物肺炎克雷伯菌进行基因分型研究，以了解这些菌株的基因分型特征㊂邵式平
材料与方法
一㊁材料
1．菌株来源：收集2012年4月至2015年4月天津市第一中心医院临床分离的非重复肺炎克雷伯菌6472株，筛选出碳青霉烯类药物不敏感(美罗培南或亚胺培南ȡ2mg/L)肺炎克雷伯菌52株，来自下呼吸道分泌物标本23株，尿液7株，无菌体液14株，血液8株㊂试验所用菌株采用法国梅里埃公司的Vitek Compat和MALDI-TOF MS进行菌种鉴定㊂使用CLSI推荐的改良Hodge试验确证碳青霉烯酶表型㊂质控菌株大肠埃希菌25922和肺炎克雷伯菌700603购自天津市卫生和计划生育委员会临检中心㊂
2．仪器和试剂:PCR扩增仪购自美国ABI公司，紫外凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司, rTaqDNA聚合酶购自日本Takara公司;PCR扩增引物由上海生物工程有限公司合成,PCR扩增产物纯化与双向测序由Invitrogen公司完成㊂E-test条购自法国生物梅里埃公司，药物标准品均购自中国药品生物制品检定所㊂
二㊁方法
1．药物敏感试验：采用微量稀释法测定哌拉西林/舒巴坦㊁头孢曲松㊁头孢他啶㊁头孢吡肟㊁厄他培南㊁亚胺培南㊁美罗培南㊁阿米卡星㊁复方磺胺甲唑㊁环丙沙星㊁左氧氟沙星的MIC值；替加环素的MIC采用E-test条法检测，实验方法及药敏判断标准参照美国FDA和CLSI的折点判读标准，并将结果输入WHONET5．6软件分析系统㊂
2．细菌总DNA的提取和检测：挑取血平皿上对数生长期的5个菌落，混悬于100μl双蒸馏水中, 95ħ10min,15400ˑg2min，测定上清液A260/A280比值，计算DNA含量，所得上清液分装并-20ħ保存备用㊂
3．多重PCR检测bla KPC㊁bla NDM-1㊁bla OXA-48㊁bla VIM和bla IMP：参照Doyle等[1]研究，扩增条件为95ħ预扩增5min,95ħ45s,60ħ45s,72ħ1min,35个循环;72ħ8min㊂引物的终浓度分别为bla KPC㊁bla VIM和bla IMP为0．3μmol/L,bla NDM-1为0．4μmol/L,bla OXA-48为0．5μmol/L㊂扩增出的序
列纯化与测序由Invitrogen公司完成，结果经美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)做Blast比对㊂4．MLST分型：使用MLST网站上提供的7个管家基因(gapA㊁infB㊁mdh㊁pgi㊁phoE㊁ropB)引物序列合成引物,94ħ2min,94ħ20s,50ħ1min, 72ħ30s,35个循环;72ħ5min㊂测序结果提交MLST网站进行序列比对以确定ST型别，网址:
www．pasteur．fr /recherche /genopole /PF8/mlst /Kpneumoniae．html㊂
结
果
一㊁体外药敏试验结果
52株肺炎克雷伯菌的体外药敏结果见表1㊂本
院分离的耐碳青霉烯类抗菌药物的肺炎克雷伯菌具有多重耐药性，对青霉素类㊁头孢类和β内酰胺类
电视新闻评论几乎全部耐药，对氨基糖苷类㊁喹诺酮类等抗菌药物也具有较高的耐药率，而对磺胺类抗菌药物耐药率较低，替加环素药敏试验显示良好的敏感性㊂
表1㊀肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药率(%)
耐药基因株数ST TZP
CAZ
CXM
FEP
AZT
IMP
MEM
AMK
CIP
LEF
SXT
TGC KPC-2
4611
100(46/46)100(46/46)100(46/46)100(46/46)100(46/46)100(46/46)100(46/46)93.5(43/46)97.8(45/46)97.8(45/46)17.4(8/46)0OXA-4831013/33/33/33/33/33/33/33/32/33/33/30OXA-481709
1/11/11/11/11/11/11/11/11/11/11/10OXA-48113931/11/11/11/11/11/11/11/11/11/11/10NDM-1
1
20681/1
1/1
1/1
1/1
1/1
1/1
1/1
1/1
1/1
1/1
1/1
㊀㊀注:TZP：哌拉西林/他唑巴坦㊁CAZ：头孢他啶㊁CXM：头孢曲松㊁FEP：头孢吡肟㊁AZT：氨曲南㊁IMP：亚胺培南㊁MEM：美罗培南㊁AMK：阿米卡星㊁CIP：环丙沙星㊁LEF：左氧氟沙星㊁SXT ：复方磺胺甲唑㊁TGC：替加环素
二㊁多重PCR 检测结果
全部52株耐碳青霉烯类抗菌药物肺炎克雷伯
菌经NCBI 做Blast 比对，主要以产KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌为主，共46株，占88．46%(46/
52)，产NDM-1型1株，占2%(1/
52)，产OXA-48型5株，占9．62%(5/52)，未检测到产VIM 型和IMP 型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌，见图1㊂
注:1为DNA 标准带,2㊁3为OXA-48型,4为NDM 型,5~7为KPC 型
图1㊀多重PCR 扩增bla OXA-48㊁bla NDM ㊁bla KPC 结果
㊀㊀三㊁MLST 分型结果
52株肺炎克雷伯菌中有46株为ST11型，有
3株为ST101型,1株为ST709型,1株为ST1393
型,1株为ST2068型㊂其中MLST 分型为ST11型的菌株均为碳青霉烯酶KPC-2型，产NDM-1型碳青霉烯酶的菌株MLST 分型为ST2068型，产OXA-48型的5株菌MLST 分型有3株ST101型,1株ST709型,1株ST1393型㊂
讨
论
近年来随着广谱抗菌药物的广泛使用，细菌的耐药性尤其是多重耐药性给抗感染带来了巨大困难，并成为全球关注的重要公共卫生问题之一㊂耐碳青霉烯类药物的肠杆菌科细菌已有许多国家和地区报道，我国局部地区也出现过产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌的暴发流行㊂
本研究分离的耐碳青霉烯类抗菌药物的肺炎克雷伯菌具有多重耐药，对青霉素类㊁头孢类和β内酰胺类几乎全部耐药，对氨基糖苷类㊁喹诺酮类等抗菌药物也具有较高的耐药率，而对磺胺类抗菌药物耐药率较低㊂与孙康德等[2]报道一致㊂全部菌株对替加环素药敏试验显示良好的敏感性㊂
耐碳青霉烯类抗菌药物的肺炎克雷伯菌从20世纪90年代出现以来迅速在世界范围内播散㊂最主要的碳青霉烯酶包括A 型(KPC 型)B 类或金属β内酰胺酶(VIM 和NDM)和D 类OXA-48型㊂KPC 型碳青霉烯酶最为多见㊂KPC 酶为可水解碳青霉烯酶类药物的β内酰胺酶,2001年由美国Yigit
等[3]在肺炎克雷伯菌中发现，命名为KPC-1，该菌表现出对亚胺培南和美罗培南高度耐药㊂自2007年起，我国也陆续报道了有关肠杆菌科细菌产KPC 酶，且主要是产KPC-2酶[4-6]㊂B 类酶包括IMP㊁VIM 和NDM 等金属酶[7]，能灭活青霉素类㊁头孢菌素和碳青霉烯类抗生素，对氨曲南无水解活性㊂D
类酶中的OXA 型酶不能水解广谱头孢菌素和氨曲
南，对亚胺培南亲合力较高，但水解效能较低[8]㊂本研究发现本院52株耐碳青霉烯抗菌药物肺炎克雷伯菌耐药基因有46株为KPC-2型，和此前文献报道一致㊂产OXA-48型肺炎克雷伯菌最早发现于2003年土耳其,2015年Ma等[9]报道我国台湾地区发现产OXA-48型肺炎克雷伯菌㊂本研究发现5株产OXA-48型肺炎克雷伯菌㊂本研究还发现1株产NDM-1型肺炎克雷伯菌㊂NDM-1最早发现于2008年的印度新德里,2011年产NDM-1的大肠埃希菌在我国香港被分离到[10]㊂Jin等[11]报道山东省发现NDM-1型肺炎克雷伯菌的小范围暴发流行㊂MLST技术是针对管家基因设计引物，通过序列的变化反映菌株之间的进化关系㊂MLST技术解决了脉冲场凝胶电泳方法中存在的不同实验室间结果缺乏比较的难题，实现全球范围的数据交流㊂本研究通过MLST分型证实我院流行的肺炎克雷伯菌主要属于ST11型，占88．46%㊂研究资料显示ST258型产KPC酶肺炎克雷伯菌在世界各地造成暴发流行，而我国报道产KPC酶的肺炎克雷伯菌主要是ST11型[12]㊂本研究结果与之一致㊂ST11和ST258有密切的亲缘关系，二者同属于CC258且相互间仅有1个MLST基因上有序列差异(tonB)㊂ST258作为产KPC肺炎克雷伯菌的主要ST型别，在美国占全部产KPC肺炎克雷伯菌的70%以上㊂有趣的是，作为ST258近亲的ST11则在亚洲成为产KPC肺炎克雷伯菌的优势菌株㊂另外本研究发现3株ST101型肺炎克雷伯菌,1株ST1393型,1株ST709型,1株ST2068型㊂这6个型别株国内罕有报道，但与国外流行株有交叉；可能来源于世界流行株国家和地区之间的携带传播㊂
本研究中46株产KPC-2型肺炎克雷伯菌经MLST分型全部为ST11型，这与文献报道相一致㊂本研究中
分离出5株产OXA-48型肺炎克雷伯菌中有3株属于ST101型，这与Meritxell Cubero报道西班牙的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐药基因主要是OXA-48型,MLST分型为ST101一致；另外有1株ST709型,1株ST1393型㊂本研究还分离出1株耐药基因为NDM-1肺炎克雷伯菌,MLST分型为ST2068型，该型是一个新发现型别，是我国南方医科大学2015年10月14日刚刚得到确认的㊂本研究对本院分离的52株耐碳青霉烯类抗菌药物肺炎克雷伯菌进行基因分析，阐明我院的耐碳青霉烯类抗菌药物肺炎克雷伯菌耐药基因主要为KPC-2型,MLST分型主要为ST11，为我院感染及防控病原菌传播提供切实有效的依据和参考㊂
参考文献幼儿发展与健康管理
[1]Doyle D,Peirano G,Lascols C,et al.Laboratory detection of
enterobacteriaceae that produce carbapenemases[J].J Clin Microbiol,2012,50(12):3877-3880.DOI:10.1128/JCM.
02117-12.
[2]孙康德，陈旭，虞中敏，等.碳青霉烯类耐药克雷伯菌属细菌偶偶视频网
的药物敏感性及同源性分析[J].检验医学,2014,11(29): 1136-1140.DOI:10.3969/j.issn.1673-8640.2014.
11.014.
[3]Yigit H,Queenan AM,Anderson GJ,et al.Novel
carbapenemhyrolyzing beta-lactamase,KPC-1,from a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumoniae[J].
Antimicron Agents Chemother,2001,45(4):1151-1161.DOI:
10.1128/AAC.45.4.1151-1161.2001.
[4]Zhang R,Zhou HW,Cai JC,et al.Plasmid-mediated
carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2in carbapenemresistant Serratia marcescens isolates from Hangzhou, China[J].Antimicrob Chemother,2007,59(3):574-576.
[5]Cai JC,Zhou HW,Zhang R,et al.Emergence of Serratiandm
marocescens,Klebsiella pneumoniae,and Escherichia coli Isolates possessing the plasmid-mediated carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-2in intensive care units of a Chinese hospital[J].
Antimicrob Agents Chemother,2008,52(6):2014-2018.DOI:
10.1128/AAC.01539-07.
[6]Hu F,Chen S,Xu X,et al.Emergence of carbapenem-resistant
clinical Enterobacteriaceae isolates from a teaching hospital in Shanghai,China[J].Med Microbiol,2012,61(1):132-136.
DOI:10.1099/jmm.0.036483-0.
[7]Krüttgen A,Razavi S,Imöhl M,et al.Real-time PCR assy and a湖北高职学校
synthetic positive control for the rapid and sensitive detection of the emerging resistance gene New Delhi metallo--lactamase-1 (blaNDM-1)[J].Med Microbiol Immunol,2011,200(2):137-141.DOI:10.1007/s00430-011-0189-y.
[8]Vila J,Marti S,Sánchez-Céspedes J.Porins,efflux purnps and
multidrug resistance in Acinetobacter baumannii[J].Antimicrob Chenother,2007,59(6):1210-1215.DOI:10.1093/jac/
dkl509.
[9]Ma L,Wang JT,Wu TL,et al.Emergence of OXA-48-Producing
Klebsiella pneumoniae in Taiwan[J].PLoS One,2015,10(9): e0139152.DOI:10.1371/journal.pone.0139152. [10]Ho PL,Lo WU,Yeung MK,et al.Complete sequencing of
pNDM-HK encoding NDM-1carbapenemase from a multidrug-resistant Escherichia coli strain isolated in Hong Kong[J].PLoS One,2011,6(3):e17989.DOI:10.1371/journal.pone.
0017989.
[11]Jin Y,Shao C,Li J,et al.Outbreak of multidrug resistant NDM-
1-producing Klebsiella pneumoniae from a neonatal unit in Shandong Province,China[J].PLoS One,2015,10(3): e0119571.DOI:10.1371/journal.pone.0119571. [12]Qi Y,Wei Z,Ji S,et al.ST11,the dominant clone of KPC-
producing Klebsiella pneumoniae in China[J].J Antimicrob Chemother,2011,66(2):307-312.DOI:10.1093/jac/
dkq431.
(收稿日期:2015-12-06)
(本文编辑：武昱)
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议