㊃论 著㊃
[收稿日期]2021-04-12
[基金项目]陕西省重点研发计划基金资助项目(2017S F -128
)[作者简介]刘泽世(1986-)
，男，河北保定人，西安交通大学第二附属医院主管技师，医学硕士，从事病原生物学检测研究㊂ *通信作者㊂E -m a i l :F l o r a b a i @163.c o m
刘泽世1，呼 瑞2，李 靖1，殷 鉴1，耿 燕1，白 露3*
(1.西安交通大学第二附属医院检验科，陕西西安710004;2.
西北妇女儿童医院重症监护室，陕西西安710061;3.空军军医大学西京医院检验科，陕西西安710032
)
[摘要] 目的评估胶体金免疫层析法快速检测血培养肠杆菌目细菌碳青霉烯酶㊂方法收集西安交通大学第二附属医院血培养79株肠杆菌目细菌，其中碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌57株和碳青霉烯类敏感肠杆菌目细菌22株，按照N G -T e s tC A R B A 5试剂盒说明书检测待测菌株五种主要碳青霉烯酶[k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e
c a r b a p e n e m a s e (K P C )㊁n e w
d
e l h im e t a l l o -β-l a c t a m a s e (N D M )㊁v e r o n a i n t e g r o n -e n c o d e d m e t a l l o -β-l a c t a m a s e (V I M )㊁i m i p e n e m a s em e t a l l o -β-l a c t a m a s e (I M P )㊁o x a c i l l i n a s e 48(O X A )-48]㊂碳青霉烯酶基因经P C R 测序确认㊂结果57株血培养碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌,N G -T e s tC a r b a5在15m i n 内检测到K P C ㊁N D M ㊁I M P ㊁K P C+N D M 和N D M+I M P ，其敏感度和特异度分别为100%和100%㊂金山川碳青霉烯酶耐药检测试剂检测到K P C ㊁N D M ㊁
I M P ㊁K P C +N D M 和N D M+I M P 的敏感度和特异度分别为94.74%和100%㊂结论N G -T e s t C A R B A5和金山川碳青霉烯酶耐药检测试剂作为高效和快速的诊断方法，可以简化临床检测碳青霉烯酶的复杂流程㊂
[关键词] 胶体金免疫层析法；碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌;N G -T e s tC A R B A 5 d o i :10.3969/j .i s s n .1007-3205.2022.02.019 [中图分类号] R 446 [文献标志码] A [文章编号] 1007-3205(2022)02-0218-05
C o m p a r a t i v e s t u d y o f c o l l o i d a l g o l d i m m u n o c h r o m a t o g r a p h y a s s a y f o r r a p
i dd e t e c t i o no f c a r b a p e n e m a s e -p r o d u c i n g E
n t e r o b a c t e r a l e s i nb l o o d c u l t u r e L I UZ e -s h i 1,HU R u i 2,L I J i n g 1,
Y I NJ i a n 1,G E N G Y a n 1,B A IL u 3*(1.D e p a r t m e n t o f L a b o r a t o r y M e d i c i n e ,t h eS e c o n dA f f i l i a t e d H o s p i t a l o f X i 'a nJ i a o t o n g U n i v e r s i t y ,
S h a a n x iP r o v i n c e ,X i 'a n 710004,C h i n a ;2.D e p a r t m e n t o f I
n t e n s i v eC a r eU n i t ,N o r t h w e s tW o m e n 's a n dC h i l d r e n 'sH o s p i t a l ,S h a a n x iP r o v i n c e ,X i 'a n 710061,C h i n a ;3.D e p a r t m e n t o f L a b o r a t o r y
M e d i c i n e ,X i j i n g H o s p i t a l ,A i rF o r c eM i l i t a r y M e d i c a lU n i v e r s i t y ,
S h a a n x iP r o v i n c e ,X i 'a n 710032,C h i n a )
[A b s t r a c t ] O b j
e c t i v e T oe v a l u a t e c o l l o i d a l g o l d i mm u n o c h r o m a t o g r a p h y a s s a y (G I C A )
巫语f o r r a p i dd e t e c t i o n o f c a r b a p e n e m a s e -p r o d u c i n
g E n t e r o b a c t e r a l e s i nb l o o d c u l t u r e .M e t
h o d s I n t o t a l ,79s t r a
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i t a lo f X i 'a n J i a o t o n g U n i v e r s i t y w e r ec o l l e c t e d ,i n c l u d i n g 57c a r b a p e n e m -r e s i s t a n tE n t e r o b a c t e r a l e sa n d22c a r b a p e n e m -s e n s i t i v eE n t e r o b a c t e r a l e s .A c c o r d i n g t
o N G -T e s tC A R B A 5k i ti n s t r u c t i o n s ,f i v e m a i n c a r b a p e n e m a s e s [k l e b s i e l
铲雪的作文l a p n e u m o n i a e c a r b a p e n e m a s e (K P C ),n e w d e l h i m e t a l l o -β-l a c t a m a s e (N D M ),v e r o n a i n t e g r o n -e n c o d e d m e t a l l o -β-l a c t a m a s e (V I M ),i m i p e n e m a s e m e t a l l o -β
-l a c t a m a s e (I M P )a n d o x a c i l l i n a s e 48(O X A )-48]o f t h e t e s t e d s t r a i n s w e r e d e t e c t e d .T h e
c a r b a p e n e m a s e g e n ew a s c o n f i r m e db yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n (P C R )s e q u e n c i n g
.R e s u l t s I n ㊃
812㊃第43卷第2期2022年2月
河
北
医
科
大
学
学
报
J O U R N A L O F H E B E I M E D I C A L U N I V E R S I T Y
V o l .43 N o .2
F e b . 2022 Copyright ©博看网. All Rights Reserved.
57s t r a i n s o f C a r b a p e n e m-r e s i s t a n t E n t e r o b a c t e r a l e s i nb l o o d c u l t u r e,K P C,N D M,I M P,K P C+ N D Ma n dN D M+I M Pw i t h i nw e r e d e t e c a t e d15m i nu s i n g N G-T e s tC a r b a5.T h e s e n s i t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y w e r e100%a n d100%r e s p e c t i v e l y.T h es e n s i t i v i t y a n ds p e c i f i c i t y o f K P C,N D M, I M P,K P C+N D Ma n dN D M+I M Pd e t e c t e db y J i n s h a n c h u a n c a r b a p e n e m a s e r e s i s t a n c e d e t e c t i o n r e a g e n tw e r e94.74%a n d100%r e s p e c t i v e l y.C o n c l u s i o n N G-T e s tC A R B A5a n dJ i
n s h a n c h u a n c a r b a p e n e m a s er e s i s t a n c e d e t e c t i o nr e a g e n t s,a se f f i c i e n ta n dr a p i d d i a g n o s t i c m e t h o d s,c a n s i m p l i f y t h e c o m p l e x p r o c e s s o f c l i n i c a l d e t e c t i o no f c a r b a p e n e m a s e.
[K e y w o r d s]i mm u n o c h r o m a t o g r a p h i c a s s a y;c a r b a p e n e m-r e s i s t a n t e n t e r o b a c t e r a l e s;
c a r b a p e n e m a s e;N G-t e s tC A R B A5
碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌(c a r b a p e n e m-r e s i s t a n t e n t e r o b a c t e r a l e s,C R E)引起的感染与较高的发病率和病死率显著相关，在C R E引起的血流感染中，病死率可高达53.1%[1-2]，患者疾病负担重㊂一项流行病学调查发现，我国89%C R E产生碳青霉烯酶[3]，可用于产碳青霉烯酶肠杆菌目细菌(c a r b a p e n e m a s e-p r o d u c i n g e n t e r o b a c t e r a l e s,C P E)的药物极少，替加环素㊁黏菌素以及头孢他啶/阿维巴坦是目前国内主要的药物㊂而对不同类型的碳青霉烯酶，头孢他啶/阿维巴坦体外抗菌活性作用不同：头孢他啶/阿维巴坦对金属酶无效，但对丝氨酸酶㊁A m p C酶以及E S B L酶敏感[4-5]㊂据报道，对于C R E血流感染的，初始抗菌药物的对提高患者生存率有重大的临床意义[6]，因此，快速检测血流感染中产碳青霉烯酶肠杆菌目细菌并进行碳青霉烯酶型的鉴定，对早期优化抗菌药物和提高生存率是必不可少的㊂本研究旨在评估两种商品化
胶体金试剂对碳青霉烯耐药肠杆菌目细菌五种主要碳青霉烯酶[k l e b s i e l l a p n e u m o n i a ec a r b a p e n e m a s e (K P C)㊁n e w d e l h i m e t a l l o-β-l a c t a m a s e(N D M)㊁v e r o n a i n t e g r o n-e n c o d e d m e t a l l o-β-l a c t a m a s e (V I M)㊁i m i p e n e m a s e m e t a l l o-β-l a c t a m a s e(I M P)㊁o x a c i l l i n a s e48(O X A)-48]的检测能力，以期为临床C P E的诊断㊁以及感染控制提供参考数据㊂1资料与方法
1.1菌株来源复苏西安交通大学第二附属医院2019 2020年血培养标本阳性非重复C R E57株和碳青霉烯类敏感肠杆菌目(c a r b a p e n e m-S e n s i t i v e E n t e r o b a c t e r a l e s,C S E)22株，包括肺炎克雷伯菌41株，大肠埃希菌14株，阴沟肠杆菌12株，产酸克雷伯菌6株，弗氏柠檬酸杆菌3株，产气肠杆菌3株㊂1.2主要仪器与试剂 V I T E K-Ⅱ-C OM P A C T鉴定仪(B i o Mér i e u x公司，法国)，血平板㊁麦康凯平板(安图公司，郑州),N G-T e s tC A R B A5检测试剂盒及阳性血培养物检测样品制备试剂盒(中生众捷生物技术，长沙)，金山川碳青霉烯酶耐药检测试剂(金山川科技发展有限公司，北京)㊂
1.3菌株鉴定复苏57株血培养细菌，经V I T E K-Ⅱ-C OM P A C T鉴定仪鉴定均为肠杆菌目细菌，且对碳青霉烯类药物耐药㊂
1.4 N G-T e s tC A R B A5滴入5滴(约150μL)提取缓冲液于无菌E P管中;1μL接种环取一环细菌样本置于含150m L提取缓冲液的E P管中，使用涡旋振荡器混合振荡几秒钟使之混合均匀；一次性移液管吸
取100μL制备好的混合液，加入到检测卡盒上标记了 S 的样本孔，加样后于室温下放置15m i n，在20m i n内读取结果㊂
1.5金山川碳青霉烯酶耐药检测试剂盒与接种待测菌株血平板恢复至室温后，于无菌E P管中滴加10滴样本处理液，使用无菌接种环挑取适量菌株至E P管中，充分搅拌，使溶液混合混匀，用移液吸取50μL稀释后的样本加至检测卡的加样孔处, 10m i n后读取结果㊂
1.6统计学方法以P C R测序结果为标准，计算N G-T e s tC A R B A5和金山川碳青霉烯酶耐药检测的敏感度㊁特异度㊂
2结果
2.1碳青霉烯酶基因的检测对57株C R E和22株
C S E采用P C R方法检测碳青霉烯酶基因(b l a K P C, b l a N
D M,b l a O X A-48-l i k e,b l a I M P和b l a V I M)㊂P C R所用引物与条件参考P o i r e l等的研究[7]㊂对P C R阳性扩增产物进行测序，并应用G e n B a n k中B l a s t进行序列比对㊂结果显示,57株C R E均检出碳青霉烯酶基因，包括b l a K P C(n=26)㊁b l a N D M (n=21)㊁b l a I M P(n=3)㊁b l a K P C+N D M(n=3)㊁b l a N D M+I M P(n=4)㊂22株C S E菌株未检测到任何碳青霉烯酶基因㊂
2.2胶体金免疫层析法酶型检测 57株C R E经
㊃912㊃
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N G -T e s tC A R B A5可检测出酶型K P C (n=26)
㊁N D M (n =21)㊁I M P (n =3)㊁K P C+N D M (n =3)
和I M P +N D M (n =4)
㊂经金山川碳青霉烯酶耐药检测可检测出酶型K P C (n =27)㊁N D M (n =23)㊁I M P (n =3)㊁K P C+N D M (n =2)和I M P+N D M (n =
2
)㊂大肠埃希菌㊁阴沟肠杆菌㊁产气克雷伯菌和弗氏柠檬酸杆菌均产单一酶型，两种检测方法结果一致㊂
肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌检出单酶型和双酶
型，其中，单酶型菌株经N G -T e s tC A R B A5和金山川碳青霉烯酶耐药检测结果一致；双酶型检测时,
N G -T e s tC A R B A5均可检测出,
而金山川碳青霉烯酶耐药检测在两种酶型时，部分菌株可检测到两
种酶型，部分菌株仅可检测出一种酶型，存在漏检
K P C 或I M P ㊂两种方法均未检测出V I M 和O X A -48-l i k e 酶型㊂22株C S E 经两种方法检测均未检出任何酶型㊂见表1㊂
表1 157株C R E 和22株C S E 经N G -T e s t C A R B A5和金山川碳青霉烯酶耐药检测酶型检测结果
T a b l e 1 I s o e n z y m e t e s t r e s u l t s o f 57C R Ea n d 22C S Eb y N G -T e s t C A R B A5a n d J i n s h a n c h u a n c a r b a p
e n e m a s e r e s i s t a n c e t e s t 细菌名称菌株数酶型N G -T e s t
C A R B A5阳性数量
敏感度(%)特异度(%)金山川碳青霉烯酶耐药检测阳性
数量敏感度(%)特异度(%)大肠埃希菌14N D M
8100.00100.008100.00100.00I M P
2100.00100.002100.00100.00肺炎克雷伯菌
41
K P C
21100.00100.0022
100.00100.00N D M
6100.00100.007100.00100.00K P C +N D M
3100.00100.00266.67100.00N D M+I M P 2100.00100.00150.00
100.00阴沟肠杆菌
12
K P C 5100.00100.005100.00100.00N D M 3100.00100.003100.00100.00I M P
1100.00100.001100.00100.00产酸克雷伯菌6N D M 2100.00100.003100.00100.00N D M+I M P
2100.00100.00150.00
100.00产气克雷伯菌3N D M 1100.00100.001100.00100.00弗氏柠檬酸杆菌3
N D M
1100.00100.001
100.00100.00总数
7957100.00
100.00
5794.74100.00
3 讨 论
碳青霉烯酶的快速检测有助于预防和控制产碳青霉烯酶细菌所引起的院内传播和感染㊂而快速鉴定碳青霉烯酶的类型有助于指导产碳青霉烯酶细菌的感染㊂据报道,b l a K P C -2和b l a N D M 是我国碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌中最常见的碳青霉烯
ndm酶基因[8]
㊂我国耐药监测网监测数据显示,C R E 耐
药形势严峻，肺炎克雷伯菌作为C R E 中耐药率上升最快的细菌，其对碳青霉烯类药物(美罗培南)的耐
药率已由2005年的2.9%攀升至2020年的26.4%㊂中国一项C R E 碳青霉烯酶分布调查显示[9]
,
产碳青霉烯酶肠杆菌目细菌高97.4%，在成人和儿童中分别流行K P C -2和N D M 酶，对产碳青霉烯酶肠杆菌目细菌快速㊁准确地检测，有助于合理选择抗菌药物，减缓细菌产生耐药性，预防和控制产酶菌株的传播㊂此外，若能进一步快速准确的区分碳青霉烯酶类型，对指导产碳青霉烯酶肠杆菌目细菌感染的具有重要意义㊂据报道，大多数产K P C -2或O X A -48样碳青霉烯酶菌株对国内20
19年新上市的酶抑制剂复合制剂头孢他啶/阿维巴坦有抗菌活性，相反，产金属酶(N D M ㊁V I M ㊁I M P )
菌株对头孢他啶/阿维巴坦不敏感，临床需根据药敏结果考虑使用其他抗菌药物，如替加环素㊁黏菌素或氨曲南/阿
维巴坦[
10]
㊂目前临床实验室开展了诸如C a r b aN P 试验㊁
改良碳青霉烯灭活试验㊁碳青霉烯酶抑制剂增强试验等表型检测方法检测碳青霉烯酶㊂C a r b aN P 试验操作简单，并可快速(4~6h )得出阳性结果，检测碳青霉烯酶的敏感度在73%~100%不等，适合所有临床微生物实验室开展，但此方法因某些特殊试
剂有效期短，需自制，颜判断受主观因素和培养基种类的影响，且对于某些类型碳青霉烯酶(如O X A -
48,-23)
检测水平较低，不推荐作为常规检测方法[11-13
]㊂值得注意的是，虽然近年来上市了一些基于C a r b a N P 试验的商品化试剂，如N e o -R a p
i d C a r bs c r e e n ,C a r b B l u es c r e e n 和i n -h o u s e C a r b a N P 等，但依然未克服对O X A -48-l i k e 型碳青霉烯
酶检测敏感度低的弊端[
14-15
]㊂改良碳青霉烯灭活试验(m o d i f i f i e d
c a r b a p
e n e mi n a c t i v a t i o nm e t h o d s ,m C I M )检测碳青霉烯酶敏感度为93%~100%㊁特异度为97%~100%，当m C I M 和E D T A -C I M 检测金属碳青霉烯酶时，敏感度为89.3%，特异度为98.7%㊂联合使用
㊃
022㊃河北医科大学学报 第43卷 第2期
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可判断出肠杆菌目细菌产生碳青霉烯酶的种类，但此种方法的不足之处在于需过夜孵育，延长临床周转时间，若存在同时产丝氨酸酶和金属β-内酰胺酶的菌株,e C I M会出现假阴性结果[16]㊂
同样，碳青霉烯酶抑制剂增强试验也需过夜孵育，其在检测产单一酶型(K P C和金属酶)时敏感度高(100%)，但检测同时产K P C和金属酶的菌株敏感度和特异度分别为96.8%和98.8%[17]，且无法检测到O X A-48酶㊂在肠杆菌中用硼酸衍生物(b o r o n i c a c i d d e r i v a t i v e s,B A)和吡啶二羧酸(d i p i c o l i n i c a c i d,D P A)/乙二胺四乙酸进行的碳青霉烯酶抑制试验㊂鉴定A㊁B和O X A-48类碳青霉烯酶的敏感性为95%㊁90%和100%，特异度为96%至100%[18]㊂
与表型检测方法相比，免疫层析法能快速简便地对临床上分离菌株进行碳青霉烯酶检测㊂有研究表明,N G-T e s tC A R B A5在血培养阳性标本中的敏感度和特异度分别在95.8%~97.7%和93.3%~ 96.1%之间[19-20]㊂N G-T e s tC A R B A5可以快速检测五种碳青霉烯酶:K P C㊁O X A-48-l i k e㊁I M P㊁N D M 和V I M，金山川碳青霉烯酶耐药检测亦可五种主要碳青霉烯酶:K P C㊁N D M㊁V I M㊁I M P㊁O X A-48㊂N G-T e s tC A R B A5和金山川碳青霉烯酶耐药检测均是胶体金免疫层析法，一个测试盒即可完成对五种的酶型的测定,20m i n内即可得到结果㊂对碳青霉烯类药物耐药肠杆菌目细菌已在
全球蔓延，如何尽早检出并针对不同酶型进行优化成为关键问题[21]㊂因此，检测碳青霉烯酶基因(如b l a K P C㊁b l a O X A-48㊁b l a I M P㊁b l a N D M和b l a V I M)对于感染的控制和选择合适的抗感染均至关重要㊂尽早的检出五种酶型，可以及时将头孢他啶阿维巴坦与其他β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂联合使用㊂五种酶型是肠杆菌目细菌常见的碳青霉烯酶型，可以区分丝氨酸β-内酰胺酶与金属β-内酰胺酶，不仅有助于优化抗生素管理，改善预后，甚至可以预防出现进一步耐药[22-23]㊂
本研究中,57株C R E分离株和22株C S E分离株经N G-T e s tC A R B A5和金山川碳青霉烯酶耐药检测㊂无论单一酶型或双酶型时,N G-T e s t C A R B A5对K P C㊁N D M㊁I M P㊁K P C+N D M和N D M+I M P的检测率均为100%，且与P C R结果一致，没有假阳性㊂金山川碳青霉烯酶耐药检测可有效检测单一酶型，且与N G-T e s tC A R B A5符合率可达100%㊂但当存在双酶型时，金山川碳青霉烯酶耐药检测部分菌株可检测出双酶型，部分菌株只能检测出其中一种酶型，存在漏检I M P或K P C 酶型，这可能与两条带表达的强度有关[24-25]㊂金山川碳青霉烯酶耐药检测没有假阳性㊂
两种胶体金方法操作简单，能快速准确的区分碳青霉烯酶酶型，有助于简化临床上常规检测碳青霉烯酶的工作流程，适用于临床快速诊断碳青霉烯酶并进行酶型区分，为临床提供确切的碳青霉烯酶型别，优化方案㊂而可能由于V I M流行率较低的原因，本次研究中并未检测到V I M㊂N G-T e s t C A R B A5和金山川碳青霉烯酶耐药检测无法区分O X A-48-l i k e的变异体(O X A-48-㊁O X A-181-㊁O X A-163-㊁O X A-232-和O X A-405型碳青霉烯酶)，如果菌株存在上述变异体型碳青霉烯酶，则可能
被认为未产O X A-48-l i k e碳青霉烯酶，从而得到假阴性结果㊂这些检测方法的检测范围有限，仅涵盖了常见的碳青霉烯酶，可能会漏检其他碳青霉烯酶，如G E S㊁I M I和G I M等㊂本实验中未检测到V I M和O X A-48酶，其原因之一可能是因为V I M和O X A-48在我国流行率不高，二是标本量不充分，未能涵盖到这两种酶型，我们仍需收集产V I M和O X A-48酶菌株，以期对两种胶体金方法检测五种主要的碳青霉烯酶的性能进行更全面的评估㊂
总之，两种试剂都为检测所有常见碳青霉烯酶提供了一种新的方法，适合于大面积初筛以确定是否产碳青霉烯酶，两种检测方法结合使用可以更好的减少C R E的发生率，在控制感染暴发应用前景广阔[26]㊂
新语文活页
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(本文编辑：刘斯静)
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