文章编号：1001-8689(2021)04-0339-07
收稿日期：2020-09-07
基金项目：国家自然科学基金(No. 81802062)；重庆市科委面上项目(No. cstc2017JcyjAX0065)；重庆市教委研究项目(No. KJQN201800402)作者简介：任艳丽，女，生于1992年，检验技师，主要研究细菌耐药机制及流行病学，E-mail:*****************
*
通讯作者，E-mail:***************
任艳丽 王云英 蒋敏 张雨虹 王燕 孙滨*
(重庆医科大学附属第二医院检验科，重庆 400010)
摘要：目的 探讨表达不同碳青霉烯酶的耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)策略，为临床有效CRE 感染提供依据。方法 回顾性分析我院2016年1月—2018年12月临床标本中分离的CRE 的相关资料
及药敏数据。复苏碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和弗氏柠檬酸杆菌，PCR 检测其携带的碳青霉烯耐药基因，并比较碳青霉烯酶表型试验与基因结果的一致性。采用肉汤稀释法检测替加环素和头孢他啶/阿维巴坦的敏感性，K-B 法检测氨曲南和头孢他啶/阿维巴坦联合作用效果。结果 CRE 对常用抗生素具有较高的耐药性。128株CRE 菌株均含碳青霉烯耐药基因，其中81株含bla KPC ，37株含bla NDM ，5株含bla IMP ，5株同时含bla KPC 和bla NDM 。酶抑制剂增强试验能够准确检测各种碳青霉烯酶酶型。替加环素的敏感率为97.6%，头孢他 啶/阿维巴坦对产丝氨酸酶菌株的敏感率为100%，而对产金属酶和双酶菌株无效。氨曲南和头孢他啶/阿维巴坦有协同作用，对产金属酶和双酶菌株有很强的抗菌活性。结论 不同酶型CRE 可考虑采用不同策略，利用酶抑制剂增强试验确定酶型后，合理选择抗生素进行有效。
关键词：耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌；碳青霉烯酶；表型检测；联合药敏；策略中图分类号：R978.1 文献标志码：A
Treatment strategies of infections with Enterobacteriaceae producing different
types of carbapenemases types
Ren Yan-li, Wang Yun-ying, Jiang Min, Zhang Yu-hong, Wang Yan, and Sun Bin
(Department of Laboratory Medicine, The Second Affi liated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400010)
Abstract Objective To investigate the therapeutic strategies against carbapenem resistant Enterobacteriaceae (CRE) expressing different carbapenemases, and provide evidence for clinical effective treatment of CRE infections. Methods A retrospective analysis was conducted on relevant information and drug sensitivity data of CRE isolated from January 2016 to December 2018. Carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli, and Citrobacter freundii were subcultured. The carbapenem resistance genes were detected by PCR, and the consistency of the carbapenemase phenotypic assays and gene results were compared. The antibiotic susceptibility tests of tigecycline and ceftazidime/avibactam were performed by the broth microdilution method. The K-B method was used to detect the effects of aztreonam combined with ceftazidime/avibactam. Results CRE had high resistance to common antibiotics. All of the 128 CRE isolates contained carbapenem resistance genes, including 81 with bla KPC , 37 with bla NDM , 5 with bla IMP , and 5 with both bla KPC and bla NDM . The carbapenemase inhibitor enhancement test could accurately detect various carbapenemases. The sensitivity of tigecycline was 97.6%. The sensitivity of ceftazidime/avibactam
碳青霉烯类抗生素通常被认为是多重耐药细菌感染的最有效抗菌药物。然而，随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，耐碳青霉烯类肠杆菌科(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE)的流行率迅速上升，已成为公众健康的严重威胁[1]。碳青霉烯酶的产生是碳青霉烯耐药的主要机制，因此，及时、准确地检测CRE，特别是产碳青霉烯酶的肠杆菌，对临床防治CRE感染具有重要意义[2]。为了克服缺乏有效抗生素的问题，抗生素联合应用是CRE感染的主要方案，不同耐药机制的细菌感染需选用不同的药物或组合[3-4]。本研究选取重庆医科大学附属第二医院2016年1月—2018年12月分离的CRE，系统的分析了其耐药模式，通过碳青霉烯酶表型试验和基因检测确定其碳青霉烯酶的种类，并重点评估了替加环素、头孢他啶/阿维巴坦及氨曲南和头孢他啶/阿维巴坦联合应用的体外抗菌活性，探索不同酶型CRE的策略，为临床有效CRE感染提供依据。
1 材料与方法
1.1菌株来源
回顾性分析重庆医科大学附属第二医院2016年1月—2018年12月临床标本中分离的CRE(亚胺培南和/或美罗培南MIC≥4μg/mL)147株，已剔除同一患者相同部位分离的重复菌株。所有菌株均用VITEK2-Compact全自动微生物分析系统进行细菌鉴定和药敏试验，结果按照2020版美国临床实验室标准化协会(CLSI)规则和标准判定[5]。复苏其中碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌(CRKP)、大肠埃希菌(CREC)和
弗氏柠檬酸杆菌(CRCF)菌种128株，用于后续检测分析。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，金黄葡萄球菌ATCC29213，粪肠球菌ATCC29212，铜绿假单胞菌ATC 27853和大肠埃希菌ATCC35218。
1.2主要仪器和试剂
哥伦比亚血平板和MH平板(美国赛默飞公司)；抗菌药物纸片(英国Oxoid公司)；头孢他啶、阿维巴坦和替加环素粉剂(大连美仑生物技术有限公司)；MH琼脂、MH营养肉汤、TSB肉汤(英国Oxoid公司)；碳青霉烯酶表型检测试剂盒(上海原科公司)；VITEK2-Compact自动化鉴定仪(法国生物梅里埃公司)；PCR相关试剂(大连TAKARA公司)；PCR仪和凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。
1.3碳青霉烯耐药基因检测
煮沸法提取细菌基因组DNA，采用PCR检测主要碳青霉烯耐药基因，包括A类丝氨酸酶(bla
KPC
和bla
IMI
)、B类金属酶(bla
NDM
和bla
IMP
)和D类丝氨酸酶
(bla
OXA-48
)，引物序列见表1。PCR反应条件：95℃预变性5min，然后95℃、30s，55℃、30s，72℃、1min，35个循环，72℃延伸10min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统观察结果。阳性扩增产物测序后经BLAST比对确认( bi.i)。
to serinase producing isolates was 100%, but it was not effective to isolates producing metallo-β-carbapenemases (MBLs) and double carbapenemases. Aztreonam had a synergistic effect with ceftazidime-avibactam, and had strong antibacterial activity against CRE producing MBLs and double carbapenemases. Conclusion Different therapeutic strategies should be considered for CRE
producing distinct carbapenemases. The antibiotics should be reasonably selected for the effective treatment against CRE after the carbapenemases type was determined by the carbapenemase inhibitor enhancement test.
Key words Carbapenem resistant Enterobacteriaceae; Carbapenemases; Phenotypic assay; Combined drug sensitivity; Treatment strategy
表1碳青霉烯耐药基因引物序列
Tab. 1Primers sequences for carbapenem resistant genes
基因引物序列(5'-3')长度/bp
bla KPC F: ATGTCACTGTATCGCCGTCT 893
R: TTTTCAGAGCCTTACTGCCC
bla IMI F: TGCGGTCGATTGGAGATAAA399
R: CGATTCTTGAAGCTTCTGCG
bla NDM F: GAGATTGCCGAGCGACTTG324
R: TACCGCCTGGACCGATGAC
bla IMP F: CATGGTTTGGTTGTTCTTGT488
R: ATAATTTAGCGGACTTTGGndm
bla OXA-48F: TTGGTGGCATCGATTATCGG438
R: GAGCACTTCTTTTGTGATGGC
1.4碳青霉烯酶表型筛选试验
1.4.1 mCIM和eCIM
根据CLSI推荐的改良碳青霉烯灭活试验(mCIM)和
联合EDTA-改良碳青霉烯酶灭活试验(eCIM)检测肠杆菌
碳青霉烯酶表型。具体操作和结果解释见CLSI[5]。
1.4.2酶抑制剂增强试验
依据“CHINET中国细菌耐药监测网”技术方
案(2020年版)，采用3-氨基苯硼酸(APB)和EDTA联合酶抑制剂增强试验法检测碳青霉烯酶类型。制备1.5×108CFU/mL大肠埃希菌ATCC25922菌悬液，均匀涂布在MH平板上，贴4片亚胺培南纸片，其中3片分别滴加10μL、30mg/mLAPB，10μL、0.1mol/L EDTA及10μL APB+10μL EDTA，35℃孵育18~24h后读取结果。含酶抑制剂合剂的抑菌圈直径与单药相差≥5mm，即为阳性。
1.5替加环素和头孢他啶/阿维巴坦药敏实验
参照CLSI M07-A9文件[6]，利用微量肉汤稀释法检测药物的MIC，替加环素浓度测定范围0.06~64μg/mL，折点判断依据FDA标准：MIC≤2mg/L为敏感，≥8mg/L为耐药。头孢他啶/阿维巴坦浓度测定范围0.25/4~64/4μg/ mL，结果判读根据2020版CLSI M100文件[5]。
1.6头孢他啶/阿维巴坦与氨曲南联合药敏试验
参照K-B法联合药敏试验[7]，检测头孢他啶/
阿维巴坦与氨曲南联合用药时产bla
NDM 、bla
IMP
及
bla
KPC +bla
NDM
碳青霉烯酶肠杆菌的抑菌圈直径。联合
药敏时，选两药抑菌圈之和的一半来贴联合纸片，判断两药的联合作用方式；两药并排贴，来判断联合药敏抑菌效果。1.7统计学分析
采用SPSS 20.0进行统计学分析。
2 结果
2.1菌株分布特征
2016年—2018年，我院共分离到非重复的CRE 147株，主要是CRKP 86株(58.5%)，CRCF 24株(16.3%)，CREC 18株(12.2%)，阴沟肠杆菌14株(9.5%)，产酸克雷伯菌2株及产气肠杆菌、日沟维肠杆菌和布氏柠檬酸杆菌各1株。主要的标本来源是痰液(30.6%)、分泌物(23.8%)、尿液(18.4%)及血液(15.6%)。主要分布在肝胆外科(19.7%)、呼吸内科(15.6%)、重症医学科(15.0%)、急诊科(8.8%)及神经外科(8.2%)。147株CRE感染患者中，男性占67.3%，大于45岁中老年占77.6%。
2.2 CRE抗菌谱分析
我院分离的147株CRE，对青霉素类和碳青霉烯类抗生素的耐药率为100%，对β-内酰胺酶复合制剂和头孢菌素的耐药率在95%以上。氨曲南的耐药率为91.8%，氨基糖苷类、喹诺酮类抗生素及复方磺胺甲恶唑的耐药性在50%~90%之间，四环素耐药率最低，为44.9%。CRKP、CREC和CRCF的抗生素敏感性略有
表2 CRE对抗菌药物的耐药率和敏感率/%
Tab. 2Resistance and susceptibility of CRE to antimicrobial agents/%
抗菌药物CRKP(n=86)CREC(n=18)CFCF(n=24)其他(n=19)合计(n=147) R S R S R S R S R S
氨苄西林10001000100010001000哌拉西林10001000100010001000阿莫西林/克拉维酸10001000100
010001000氨苄西林/舒巴坦10001000100010001000哌拉西林/三唑巴坦1000100095.8 4.2100099.30.7头孢唑林10001000100010001000头孢呋辛10001000100010001000头孢他啶10001000100094.7 5.399.30.7头孢噻肟10001000100010001000头孢曲松10001000100010001000头孢吡肟97.7094.4095.8084.2 5.395.20.7头孢替坦95.3 2.31000100094.7 5.396.6 2.0氨曲南100072.227.8752594.7 5.391.88.2亚胺培南10001000100010001000美罗培南10001000100010001000庆大霉素94.2 5.861.138.983.316.768.426.385.014.3妥布霉素91.9 5.844.433.366.720.852.615.876.912.9阿米卡星87.212.816.783.316.783.315.873.757.840.8环丙沙星90.7 5.888.911.17520.842.131.681.612.2左氧氟沙星89.57.088.911.154.220.836.836.876.913.6复方磺胺甲噁唑60.539.577.822.2505052.647.459.940.1四环素43.040.783.316.729.266.736.847.444.942.9
不同。CRE对常见抗生素的药敏结果详见表2。
2.3碳青霉烯耐药基因检测结果
PCR检测结果显示，复苏的128株CRE菌株均
含碳青霉烯耐药基因。其中81株含bla
KPC ，37株含
bla
NDM ，5株含bla
IMP
，5株同时含bla
KPC
和bla
NDM
。86
株CRKP中，以产bla
KPC 为主，占88.4%，产bla
NDM-1
的菌株占5.8%，其余5.8%为产bla
KPC 和bla
NDM
双酶。
18株CREC中，以产bla
NDM 为主，占94.4%，1株产
bla
KPC 。24株CRCF中，产bla
NDM
占62.5%，产bla
KPC
占
16.7%，产bla
IMP
占20.8%。代表性电泳图见图1。
2.4表型筛选试验结果
mCIM和eCIM结果显示，产丝氨酸酶(bla
KPC
罗兰巴尔特)和
产双酶(bla
KPC
+bla
NDM
)菌株表现为mCIM阳性、eCIM
阴性；产金属酶(bla
NDM
或bla
IMP
)表现为mCIM和eCIM
均阳性；mCIM和eCIM不能够鉴别出产双酶菌株(图
2和表3)。酶抑制剂增强试验表明，81株产丝氨酸
酶，42株产金属酶，5株产双酶，结果与基因检测结
果一致，见图2和表3。
Marker bla KPC bla NDM bla IMP
bla KPC+bla NDM
1000
700
500
400
300
200
100电脑爱好者2012
图1碳青霉烯耐药基因电泳示意图
Fig. 1Electrophoretic map of carbapenem resistant gene
bla KPC bla NDM bla IMP bla KPC+bla NDM
阴性对照
eCIM mCIM
阴性对照
eCIM mCIM
IMP+P+E
IMP
IMP+E
IMP+P
IMP+P+E
IMP
IMP+E
IMP+P
IMP+P+E
IMP
IMP+E
合成氨论文IMP+P IMP+P+E
IMP
IMP+E
IMP+P
阴性对照
eCIM mCIM
阴性对照
eCIM mCIM mCIM
+
eCIM
酶抑
制剂
核磁共振氢谱增强
试验
IMP：亚胺培南；P：3-氨基苯硼酸；E：EDTA
图2碳青霉烯酶表型筛选试验阳性示意图
Fig. 2Positive diagrams of carbapenemase phenotypic screening assay 表3表型试验结果分析
Tab.3 Analysis of phenotypic assay results
碳青霉烯酶/株
mCIM+eCIM/株酶抑制剂增强试验/株是否
一致丝氨酸酶金属酶丝氨酸酶金属酶双酶
bla KPC(81)8108100是bla NDM(37)0370370是bla KPC+NDM(5)50005否bla IMP(5)05050是2.5替加环素药物敏感性结果
128株CRE替加环素的敏感率为97.6%，中介率为0.8%，耐药率为1.6%。微量肉汤稀释法显示其MIC
50
为0.5μg/mL，MIC
90
为1μg/mL。且不同菌种之间(χ2=1.500，P=0.872)，不同酶型之间(χ2=3.211，P=0.523)，替加环素的药敏结果无统计学差异。详细结果见表4。
2.6 头孢他啶/阿维巴坦药物敏感性结果
128株C R E 头孢他啶/阿维巴坦的敏感率为63.7%，耐药率为36.7%。微量肉汤稀释法显示其MIC 50为4/4μg/mL ，MIC 90为>64/4μg/mL 。产丝氨酸酶(bla KPC )的菌株头孢他啶/阿维巴坦的敏感率为100%，而产金属酶(bla NDM /bla IMP )和产双酶(bla KPC+NDM )的耐药率为100%。纸片扩散法与微量肉汤稀释法的结果一致。具体结果见表5。2.7 头孢他啶/阿维巴坦和氨曲南联合药敏分析
表4 替加环素药敏试验结果
Tab. 4 Antibiotic susceptibility testing results of tigecycline
菌株/碳青霉烯酶(n )敏感率/%中介率/%耐药率
/%MIC/(μg/mL )MIC 范围MIC 50MIC 90CRKP(86)96.5 1.2 2.30.125~160.51 bla KPC (76)97.40 2.60.125~160.51 bla NDM (5)802000.25~4// bla KPC+NDM (5)100000.5~2//CREC(18)100000.125~10.1250.5 bla KPC (1)100000.125// bla NDM (17)100000.125~10.1250.5CRCF(24)100000.125~10.251 bla KPC (4)100000.125~0.5// bla NDM (15)100000.25~10.250.25 bla IMP (5)100000.25~1//CRE 合计(128)
97.6
0.8
1.6
0.125~16
0.5
1
表5 头孢他啶/阿维巴坦药敏试验结果
Tab. 5 Antibiotic susceptibility testing results of ceftazidime-avibactam
菌株/碳青霉烯酶(n )敏感率/%耐药率
/%KB
/mm MIC/(μg/mL)MIC 范围MIC 50MIC 90CRKP(86)88.411.614~271/4~>64/44/416/4 bla KPC (76)100022~271/4~8/44/48/4 bla NDM (5)010015~1816/4~>64/4// bla KPC+NDM (5)010014~16>64/4//CREC(18) 5.694.411~232/4~>64/4
>64/4>64/4 bla KPC (1)1000232/4// bla NDM (17)010011~18>64/4>64/4>64/4CRCF(24)16.783.38~261/4~>64/4>64/4>64/4 bla KPC (4)100024~261/4~8/4// bla NDM (15)01008~15>64/4>64/4>64/4 bla IMP (5)010013~16>64/4//CRE 合计(128)
63.3
36.7
卫生带
8~27
1/4~>64/4
4/4
>64/4
bla NDM
bla IMP
bla KPC+NDM
ATM ATM
ATM ATM
ATM
ATM ATM
ATM ATM
ATM
ATM
ATM
CZA
CZA
CZA
CZA
CZA
CZA CZA
CZA
CZA
CZA
CZA
CZA 图3 头孢他啶-阿维巴坦与氨曲南联合药敏结果
Fig. 3 Antibiotic susceptibility testing of ceftazidime-avibactam combined with aztreonam
42株产金属酶(b l a N D M 或b l a I M P )和产双酶(bla KPC+NDM )的CRE ，头孢他啶/阿维巴坦的抑
菌圈直径为8~18mm ，敏感率为0；氨曲南的抑菌圈直径为6~24mm ，敏感率为26.2%。体外药敏试验显示氨曲南和头孢他啶/阿维巴坦具有协同作用，二者联合使用，抑菌圈直径显著增大，达到22~30mm ，均在敏感范围，见图3。3 讨论
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