棉花叶皱缩病毒诱导的基因沉默体系的建立及其应用别了 我爱的中国
棉花是世界上最重要的经济作物之一,开展棉花抗病虫、抗逆境等功能基因的研究对于提高棉花的产量和品质以及棉花产业的发展具有巨大的推动作用。生产上广泛使用的陆地棉和海岛棉均为异源四倍体,生长周期长,基因组比较大,遗传转化效率低,使得传统的T-DNA插入和化学诱导的突变等方法很难用于棉花功能基因组学的研究。 因此,迫切需要建立一套快速、高通量的反向遗传学手段对棉花的功能基因开展相关研究。本论文将原本只适用于基因轰击的棉花叶皱缩病毒(Cotton leaf crumple virus, CLCrV)载体改造为适用于农杆菌浸润的病毒诱导的基因沉默(VIGS)载体pCLCrVA。
dac基因该载体能与CLCrV的DNA-B组份共同侵染棉花,且不产生表型。利用该体系不仅可以在棉花中开展基因功能研究,而且可以用于过量表达microRNA (miRNA)、短串联靶标类似物(short tandem target mimic,STTM)和人工miRNA (artificial miRNA)。水分检测
利用该载体我们在棉花中有效的抑制了镁离子螯合酶亚基Ⅰ型(CHLI)和延长因子1α (EF-1α)这两个内源基因以及转基因棉花中苏云金杆菌crylA基因的表达量。此外,利用该载体还可以在陆
地棉植株中异源过量表达miR156,引起miR156的靶标mRNA的表达量下降,产生叶片发育异常的表型。
该载体还可用于在棉花体内异源表达针对miR165/miR166的STTM结构从而抑制miRNA的功能,产生叶片下卷和皱缩的症状,并且导致miR165/miR166的靶标mRNA的表达量显著提高。经过改造的CLCrV VIGS载体操作简便,能够在多个不同的棉花品种上引起稳定、持续的基因沉默表型,为棉花功能基因组的研究提供了强有力的手段。
利用CLCrV沉默载体,开展了棉花功能基因的研究。LYK (Lysin Motif Receptor-Like Kinase)家族蛋白是一类重要的受体蛋白,在拟南芥、水稻等植物抵抗真菌侵染过程中扮演了重要角。
为了研究LYK蛋白在棉花抗黄萎病中的作用,利用生物信息学的方法从棉花基因组中寻到拟南芥LYK的5个同源基因,命名为GhLYK1至GhLYK5。利用qRT-PCR检测发现,棉花抗病品种3503受到大丽轮枝菌侵染后LYK家族的Gh-LYK1和Gh-LYK2的表达量明显上调。旷场实验
利用CLCrV载体分别沉默了Gh-LYK1和Gh-LYK2之后再接种黄萎病菌,发现与非沉默植株相
我是侦察兵
比,沉默Gh-LYK1或Gh-LYK2的植株对黄萎病的抵抗力减弱,病情指数显著升高,表明Gh-LYK1和Gh-LYK2在棉花抵抗黄萎病中具有重要作用。利用几丁质结合实验发现Gh-LYK1和Gh-LYK2的胞外区均能够结合几丁质；利用体外磷酸化实验发现Gh-LYK1的胞内区具有激酶活性,但是Gh-LYK2的胞内区虽然预测有激酶的功能域,但该功能域是没有活性的。
通过序列分析发现棉花感病品种ZN905和Jun1的Gh-LYK2均缺失了跨膜区。在感病品种Zn905中沉默Gh-LYK2后,沉默植株对大丽轮枝菌的敏感性没有增加,表明缺失了该基因在感病品种中不起作用。
对Gh-LYK2的亚细胞定位进行分析,发现感病品种中的Gh-LYK2虽然缺失了跨膜区,但其仍然定位于细胞膜。我们推测跨膜区的缺失导致Gh-LYK2穿过磷脂双分子层时,部分LysM功能域嵌入了磷脂双分子层,导致其识别几丁质的能力丧失,从而失去功能。
下一步将继续研究跨膜区在识别几丁质信号传递中的作用。
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