盐酸金刚烷胺ｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆｂｒａｉｎｇｌｉｏｍａｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｅｄｉａｔｒｉｃＳｕｒｇｅｒｙ，２０１８，３９（５）：３５１－３５５．
［１２］ 雷波，詹傲，张召，等．长链非编码ＲＮＡＡＴＢ调控ｍｉＲ－１４４
对胶质瘤迁移和侵袭的影响［Ｊ］．安徽医学，２０１８，３９（１０）：１１８９－１１９３．
ＬＥＩＢ，ＺＨＡＮＡ，ＺＨＡＮＧＳ，ｅｔａｌ．Ｌｏｎｇｃｈａｉｎｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡＡＴＢｒｅｇｕｌａｔｅｓｅｆｆｅｃｔｏｆｍｉＲ－１４４ｏｎｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｇｌｉｏｍａ［Ｊ］．ＡｎｈｕｉＭｅｄｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，２０１８，３９（１０）：１１８９－１１９３．
［１３］ ＷＡＮＧＤ，ＷＵＷ，ＨＵＡＮＧＷ，ｅｔａｌ．ＬｎｃＲＮＡＬＵＡＤＴ１ｓｐｏｎｇｅｓ
ｍｉＲ－１５ａ－３ｐｔｏｕｐｒｅｇｕｌａｔｅＴｗｉｓｔ１ｉｎｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＢＭＣＰｕｌｍＭｅｄ，２０１９，１９（１）：２４６．
［１４］ ＨＥＺ，ＲＵＡＮＸ，ＬＩＵＸ，ｅｔａｌ．ＦＵＳ／ｃｉｒｃ＿００２１３６／ｍｉＲ－
１３８－
５ｐ／ＳＯＸ１３ｆｅｅｄｂａｃｋｌｏｏｐｒｅｇｕｌａｔｅｓａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｇｌｉｏｍａ［Ｊ］．ＪＥｘｐＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ，２０１９，３８（１）：６５．
［１５］ ＺＨＡＯＣ，ＬＩＮＧＸ，ＬＩＸ，ｅｔａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１３８－５ｐｉｎｈｉｂｉｔｓｃｅｌｌ
ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ｉｎｖａｓｉｏｎａｎｄＥＭＴｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｂｙｄｉｒｅｃｔｌｙｔａｒｇｅｔｉｎｇＲＨＢＤＤ１［Ｊ］．ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒ，２０１９，２６（６）：８１７－８２５．
［１６］ ＷＡＮＧＺ，ＹＡＯＹＪ，ＺＨＥＮＧＦ，ｅｔａｌ．ＭｉＲ－１３８－５ｐａｃｔｓａｓａ
ｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｂｙｔａｒｇｅｔｉｎｇｐｙｒｕｖａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｋｉｎａｓｅ１ｉｎｈｕｍａｎｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ［Ｊ］．ＥｕｒＲｅｖＭｅｄＰｈａｒｍａｃｏｌＳｃｉ，２０１７，２１（２４）：５６２４－５６２９．
［１７］ 胡铭阳，明佳．ｌｎｃＲＮＡ与ｍｉＲＮＡ相互调控机制的研究进展
［Ｊ］．转化医学电子杂志，２０１７，４（２）：７１－７６．
ＨＵＭＹ，ＭＩＮＧＪ．ＲｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｌｎｃＲＮＡａｎｄｍｉＲＮＡｍｕｔｕａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｅ－ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，２０１７，４（２）：７１－７６．
［１８］ ＹＡＮＧＭ，ＳＵＮＳ，ＧＵＯＹ，ｅｔａｌ．Ｌｏｎｇｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡＭＣＭ３ＡＰ
－ＡＳ１ｐｒｏｍｏｔｅｓｇｒｏｗｔｈａｎｄｍｉｇｒａｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈｍｏｄｕｌａｔｉｎｇＦＯＸＫ１ｂｙｓｐｏｎｇｉｎｇｍｉＲ－１３８－５ｐｉｎｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＭｏｌＭｅｄ，２０１９，２５（１）：５５．
［１９］ ＺＨＡＯＹ，ＺＨＡＯＬ，ＬＩＪ，ｅｔａｌ．ＳｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡ
ＲＰ１１－４７６Ｄ１０．１ｅｎｈａｎｃｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄａｕｔｏｐｈａｇｙｗｈｉｌｅｉｎｈｉｂｉ ｔｉｎｇｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｐａｐｉｌｌａｒｙｔｈｙｒｏｉｄｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓｖｉａｍｉｃｒｏＲＮＡ－１３８－５ｐｄｅｐｅｎｄｅｎｔｉｎｈ
ｉｂｉｔｉｏｎｏｆＬＲＲＫ２［Ｊ］．ＪＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１９，２３４（１１）：２０９８０－２０９９１．
（编校：徐萌）
郭池华，赵 妍，刘 焕，郭玉芳，王 湘，王 爽，徐 浩
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆａｎａｌｇｅｓｉｃｅｆｆｅｃｔｏｆｚｏｌｅｄｒｏｎｉｃａｃｉｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｏｎｂｏｎｅｃａｎｃｅｒｐａｉｎｒａｔｓ
ＧＵＯＣｈｉｈｕａ，ＺＨＡＯＹａｎ，ＬＩＵＨｕａｎ，ＧＵＯＹｕｆａｎｇ，ＷＡＮＧＸｉａｎｇ，ＷＡＮＧＳｈｕａｎｇ，ＸＵＨａｏ
ＳｃｈｏｏｌｏｆＢａｓｉｃＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｘｉ＇ａｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＳｈａａｎｘｉＸｉ＇ａｎ７１００２１，Ｃｈｉｎａ．
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅａｎａｌｇｅｓｉｃｅｆ
ｆｅｃｔａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｚｏｌｅｄｒｏｎｉｃａｃｉｄ（ＺＯＬ）ｏｎｂｏｎｅｃａｎｃｅｒｐａｉｎｒａｔｓｂｙｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ｉ．ｔ．）ａｎｄｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ｓ．ｃ．）．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｂｏｎｅｃａｎｃｅｒｐａｉｎ（ＢＣＰ）ｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆＷａｌｋｅｒ２５６ｍａｍｍａｒｙｇｌａｎｄｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓｉｎｔｏｔｈｅｔｉｂｉａｏｆｆｅｍａｌｅＳＤｒａｔｓ．ＴｈｅＨａｒｇｒｅａｖｅｓｔｅｓｔｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏｃｏｍｐａｒｅｔｗｏａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＺＯＬｏｎｂｏｎｅｃａｎｃｅｒｐａｉｎｂｅｈａｖｉｏｒｏｆｒａｔｓａｆｔｅｒｓｉｎｇｌｅｏｒｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．ＲＴ－ＰＣＲ，ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆＩＢＡ－１ｉｎｔｈｅｓｐｉｎａｌｄｏｒｓａｌｈｏｒｎ．ＲｏｔａｒｏｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｎｄｏｐｅｎｆｉｅｌｄｔｅｓｔｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＺＯＬｉｎｔｈｅｍｏｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｌｏｃｏｍｏｔｏｒａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｒａｔｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｓｉｎｇｌｅｏｒｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｉ．ｔ．ｏｒｓ．ｃ．ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆＺＯＬｃｏｕｌｄｓｉｇｎｉｆｉ ｃａｎｔｌｙｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｔｈｅｒｍａｌｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａｏｆｒａｔｓ（Ｐ＜０．０５），ａｎｄｔｈｅａｎａｌｇｅｓｉｃｅｆｆｅｃｔｏｆｉ．ｔ．ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｗａｓｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｓ．ｃ．ｉｎ
ｊｅｃｔｉｏｎ（Ｐ＜０．０５）．ＲＴ－ＰＣＲ，ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＢＡ－１ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｅｄａｆｔｅｒｉ．ｔ．ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆＺＯＬｆｏｒ７ｄａｙｓｉｎｂｏｎｅｃａｎｃｅｒｐａｉｎｒａｔｓ（Ｐ＜０．０５），ｂｕｔｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｓ．ｃ．ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆＺＯＬｈａｄｎｏｓｕｃｈｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔ（Ｐ＞０．０５）．ｉ．ｔ．ｏｒｓ．ｃ．ｉｎ ｊｅｃｔｉｏｎｏｆＺＯＬｄｉｄｎｏｔａｆｆｅｃｔｔｈｅｍｏｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｒａｔｓ（Ｐ＞０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｓ．ｃ．ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆＺＯＬ，ｉ．ｔ．ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆＺＯＬｈａｓｓｔｒｏｎｇｅｒａｎａｌｇｅｓｉｃｅｆｆｅｃｔｉｎｂｏｎｅｃａｎｃｅｒｐａｉｎｒａｔｓ，ａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｓｐｉｎａｌ
【收稿日期】 ２０２０－０７－０７【修回日期】 ２０２０－０７－３０
【基金项目】 国家自然科学基金项目（编号：８１８０３０９９）【作者单位】 西安医学院基础医学部，陕西 西安 ７１００２１
【作者简介】 郭池华（１９８７－），男，陕西西安人，讲师，主要从事骨癌痛镇痛相关机制研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｕｏｃｈ８７＠ｙｅａｈ．ｎｅｔ
【通讯作者】 徐浩（１９８３－），男，陕西西安人，副教授，主要从事神经病理性痛发生发展相关机制研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓａｍｘｕｈａｏ＠１６３．ｃｏｍ
·
５７３·现代肿瘤医学 ２０２１年２月 第２９卷第０３期 ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｆｅｂ ２０２１，ＶＯＬ ２９，Ｎｏ ０３
ｍｉｃｒｏｇｌｉａｍａｙｂｅｏｎｅｏｆｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｚｏｌｅｄｒｏｎｉｃａｃｉｄｅｘｅｒｔｓａｎａｌｇｅｓｉｃｅｆｆｅｃｔｗｉｔｈｏｕｔａｎｙｏｂｖｉｏｕｓｍｅａｓ ｕｒａｂｌｅｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｅｆｆｅｃｔｓ．
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ｂｏｎｅｃａｎｃｅｒｐａｉｎ，ｚｏｌｅｄｒｏｎｉｃａｃｉｄ，ａｎａｌｇｅｓｉａ，ｍｉｃｒｏｇｌｉａａｃｔｉｖａｔｉｏｎ
ＭｏｄｅｒｎＯｎｃｏｌｏｇｙ２０２１，２９（０３）：０３７５－０３８０
【摘要】 目的：通过对鞘内注射和皮下注射两种给药方式的比较，探讨唑来膦酸对骨癌痛大鼠的镇痛效应及其可能机制。方法：将Ｗａｌｋｅｒ２５６乳腺癌细胞注入雌性ＳＤ大鼠胫骨以建立骨癌痛模型，单次或者持续给予唑来膦酸后，比较鞘内和皮下两种给药方式对大鼠痛行为学的影响。采用Ｒ Ｔ－ＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和免疫荧光染的实验方法观察脊髓背角ＩＢＡ－１的改变情况。采用旷场实验和转棒实验观察唑来膦酸两种给药方式对大鼠运动功能和自发活动功能的影响。结果：单次或连续鞘内或皮下注射唑来膦酸均可显著改善大鼠热痛敏反应（Ｐ＜０．０５），并且鞘内注射的镇痛效应强于皮下注射（Ｐ＜０．０５）。ＲＴ－ＰＣＲ、免疫荧光染和Ｗｅｓｔ ｅｒｎｂｌｏｔ结果表明，持续鞘内注射唑来膦酸７天后，骨癌痛大鼠脊髓背角表达增高的ＩＢＡ－１被显著抑制（Ｐ＜０．０５），而皮下注射并无此抑制效应（Ｐ＞０．０５）。唑来膦酸的两种给药方式均未影响大鼠的运动功能和自发活动功能（Ｐ＞０．０５）。结论：相比皮下注射，鞘内注射唑来膦酸在大鼠骨癌痛模型中表现出更强的镇痛效应，而抑制脊髓小胶质细胞的活化可能是其镇痛机制之一，此外，唑来膦酸在两种给药方式中均未表现出明显的神经毒副作用。 【关键词】骨癌痛；唑来膦酸；镇痛效应；小胶质细胞活化
【中图分类号】Ｒ７３８．１ 【文献标识码】Ａ ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－４９９２．２０２１．０３．００３
【文章编号】１６７２－４９９２－（２０２１）０３－０３７５－０６
骨癌痛是一种难以控制的顽疾，严重影响肿瘤患者的身心健康［１］。在临床上乳腺癌、肺癌、前列腺癌常常发生骨转移，发生骨转移的肿瘤会不断的侵袭和破坏正常骨组织结构引起骨癌痛［２－３］。
由于目前临床手段的局限性，依旧有大量骨癌痛患者的症状没有得到妥善的控制。因此研究骨癌痛的发生发展机制，寻骨癌痛的新靶点，提高骨癌痛患者的生活质量迫在眉睫［４］。
目前骨癌痛最常用的模型是运用大鼠Ｗａｌｋｅｒ２５６乳腺癌细胞注射至大鼠胫骨骨髓腔，建立乳腺癌胫骨转移引起的骨癌痛模型［５－６］。该模型操作方面可重复性高，是理想的大鼠骨癌痛模型，因此本研究选取此模型进行实验。
唑来膦酸属于第３代双膦酸盐类药物，是公认有效骨转移减缓骨癌痛的药物，但缓解骨癌痛的机制尚不清楚［７］。本研究在大鼠骨癌痛模型中，通过单次及连续给药方式，详细对比鞘内注射和皮下注射唑来膦酸不同的镇痛效应，并探讨其可能的中枢镇痛机制。
１ 材料和方法
１．１ 材料
１．１．１ 实验动物 实验动物为雌性ＳＤ大鼠，由西安交通大学实验动物中心提供。模型大鼠体重为１８０～２００ｇ。用于培养Ｗａｌｋｅｒ２５６大鼠乳腺癌细胞的大鼠体重为８０～１００ｇ。实验动物均饲养于标准透明塑料饲养笼中，自由摄食饮水。室温２２～２５℃，保证正常１２ｈ／１２ｈ昼夜节律。所有动物实验均严格遵守西安医学院动物伦理委员会的要求，尽可能的减少动物使用数量和所遭受的痛苦。
１．１．２ 主要药物和试剂 Ｗａｌｋｅｒ２５６大鼠乳腺癌细胞购于美国模式菌种收集中心（Ａｍｅｒｉｃａｎｔｙｐｅｃｕｌｔｕｒｅｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ），培养细胞并调节细胞浓度最终为２×１０６个／ｍＬ。唑来膦酸购于美国Ｓｉｇｍａ公司。山羊源ＩＢＡ－１抗体购于英国Ａｂｃａｍ公司。ＡｌｅｘＦｌｕｏｒ４８８ｄｏｎｋｅｙａｎｔｉ－ｇｏａｔ购于美国Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。人工脑脊液购于武汉纯度生物科技有限公司。
１．２ 实验方法１．２．１ 骨癌痛模型的建立 依据我们之前实验［８－９］，雌性ＳＤ大鼠２％钠（０．２ｍＬ／１００ｇ）麻醉合适后，仰卧位固定在手术台上。在大鼠右胫骨中上１／３处备皮，妥善消毒皮肤，于胫骨结节周围做５ｍｍ切口，暴露胫骨。使用１ｍＬ注射器针头在骨面平台打孔，出现落空感后拔出针头，可见骨髓流出。使用２０μＬ微量注射器先吸取之前制备的Ｗａｌｋ ｅｒ２５６细胞悬液１０μＬ，沿小孔注入骨髓腔中，并妥善封闭防止肿瘤细胞悬液外渗。假手术组注射入等量生理盐水。１．２．２ 鞘内置管 雌性ＳＤ大鼠２％钠（０．２ｍＬ／１００ｇ）麻醉合适后，俯卧位固定于手术台上。在大鼠胸腰段正中位置做２ｃｍ切口。分离脊柱两旁肌肉暴露棘突，取过屈体位在棘突下插入ＰＥ－１０导管，导管突破硬膜时鼠尾轻微摆动，注意不要损伤脊髓。导管插入深度Ｔ８至Ｌ３位置。导管的另一端通过皮下隧道从两耳中间位置传出用于鞘内给药。置管完成后观测大鼠后肢活动情况以证明脊髓是否完好，如有异常证明置管失败。
１．２．３ 分组和给药 分组：评价骨癌痛大鼠痛行为学变化时，将２４只大鼠分为３组，每组８
只：①对照组（Ｎａ ｖｅ组）；
②假手术组（Ｓｈａｍ组）；③骨癌痛模型组（ＢＣＰ组）。在评价单次给药对大鼠痛行为学影响时，将６４只大鼠随机分为８组，每组８只：①假手术组（Ｓｈａｍ组）；②骨癌痛模型组（ＢＣＰ组）；③鞘内注射低剂量唑来膦酸组（ｉ．ｔ．ｌ－ＺＯＬ＋ＢＣＰ组）；
④鞘内注射中剂量唑来膦酸组（ｉ．ｔ．ｍ－ＺＯＬ＋ＢＣＰ组）；⑤鞘内注射高剂量唑来膦酸组（ｉ．ｔ．ｈ－ＺＯＬ＋ＢＣＰ组）；⑥皮下注射低剂量唑来膦酸组（ｓ．ｃ．ｌ－ＺＯＬ＋ＢＣＰ组）；⑦皮下注射中剂量唑来膦酸组（ｓ．ｃ．ｍ－ＺＯＬ＋ＢＣＰ组）；⑧皮下注射高剂量唑来膦酸组（ｓ．ｃ．ｈ－ＺＯＬ＋ＢＣＰ组）。在评价连续给药对大鼠痛行为学影响时，依照单次给药结果选择最合适的药物浓度，即中等剂量浓度。将３２只大鼠随机分为４组，每组８只：①假手术组（Ｓｈａｍ组）；②骨癌痛模型组（ＢＣＰ组）；③鞘内注射唑来膦酸组（ｉ．ｔ．ＺＯＬ＋ＢＣＰ组）；④皮下注射唑来膦酸组（ｓ．ｃ．ＺＯＬ＋ＢＣＰ组）。评价药物毒副作用时，将２４只正常大鼠随机分为３组，每组８只：①正常大鼠组（Ｎａ ｖｅ组）；
·
６阈值效应
７
３
·郭池华，等 唑来膦酸不同给药方式对骨癌痛大鼠镇痛作用的比较
②鞘内注射唑来膦酸组（ｉ．ｔ．ＺＯＬ组）；③皮下注射唑来膦酸组（ｓ．ｃ．ＺＯＬ组）。
给药：评价单次给药对大鼠痛行为学影响时，在造模第１４天开始给药，给药剂量依照文献报道和预实验结果［１０－１１］，剂量分别为：ｉ．ｔ．ｌ－ＺＯＬ＋ＢＣＰ组，鞘内注射ＺＯＬ１０ｎｇ／１００ｇ；ｉ．ｔ．ｍ－ＺＯＬ＋ＢＣＰ组，鞘内注射ＺＯＬ２０ｎｇ／１００ｇ；ｉ．ｔ．ｈ－ＺＯＬ＋ＢＣＰ组，鞘内注射ＺＯＬ４０ｎｇ／１００ｇ；ｓ．ｃ．ｌ－ＺＯＬ＋ＢＣＰ组，皮下注射５μｇ／１００ｇ；ｓ．ｃ．ｍ－ＺＯＬ＋ＢＣＰ组，皮下注射１０μｇ／１００ｇ；ｓ．ｃ．ｈ－ＺＯＬ＋ＢＣＰ组，皮下注射２０μｇ／１００ｇ。评价连续给药对大鼠痛行为学影响时，在造模第１４天开始给药，给药剂量依照文献报道和预实验结果［９－１０］，间隔１天给药，剂量分别为：ｉ．ｔ．ＺＯＬ＋ＢＣＰ组，鞘内注射ＺＯＬ２０ｎｇ／１００ｇ；ｓ．ｃ．ＺＯＬ＋ＢＣＰ组，皮下注射１０μｇ／１００ｇ。评价药物毒副作用时，正常大鼠给予高剂量ＺＯＬ，间隔１天给药，剂量分别为：ｉ．ｔ．ＺＯＬ组，鞘内注射ＺＯＬ４０ｎｇ／１００ｇ；ｓ．ｃ．ＺＯＬ组，皮下注射２０μｇ／１００ｇ。鞘内注射所用溶剂为ＡＣＳＦ，腹腔注射所用溶剂为生理盐水。
１．２．４ 热痛敏检测 使用热痛刺激仪检测大鼠热痛敏。参照之前实验方法，设置热量强度使正
常大鼠热缩足潜伏期为１６ｓ［８－９］。在安静环境中使大鼠充分适应。热痛刺激仪刺激大鼠右后肢足底中部皮肤，若大鼠抬脚回避时，停止刺激记录时间。此时间为大鼠热缩足潜伏期（ｐａｉｎｗｉｔｈｄｒａｗａｌｌａｔｅｎ ｃｙ，ＰＷＬ）。为了防止大鼠被烫伤，热痛刺激仪切断时间设置为２０ｓ。评价单次给药对大鼠痛行为学影响时，给药后１、２、４ｈ进行痛行为学检测。评价连续给药对大鼠痛行为学影响时，给药后１、３、５、７ｄ进行痛行为学检测。
１．２．５ 旷场试验 用于检测药物对自发活动的影响。方法大致如下，在安静通风的房间内放置旷场，规格为１００ｃｍ×１００ｃｍ×５０ｃｍ。实验条件为弱光照明并严格控制室内温度和湿度。测试前先将大鼠放入旷场熟悉环境５ｍｉｎ，然后把大鼠置于旷场中央，使用视频记录系统记录大鼠在旷场里的活动情况１５ｍｉｎ。１５ｍｉｎ后计算大鼠自发活动速度和中央活动时间占总时间百分比。
１．２．６ 转棒实验 用于评估药物对运动协调能力的影响。实验前３ｄ使大鼠适应转棒系统后进行实验。方法大致如下，调节转棒系统速度为１２ｒ／ｍｉｎ，将大鼠置于上方，记录１５ｍｉｎ内大鼠在转棒上的停留时间。记录给药后占给药前停留时间的百分比。给药后１、３、５、７ｄ进行检测。
１．２．７ ＲＴ－ＰＣＲ 依据试剂盒说明提取脊髓总ＲＮＡ后，利用ＯＤ
２６０
分光光度法检测标本总ＲＮＡ浓度及纯度。反转录试剂盒逆转录合成ｃＤＮＡ后，ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒进行ＰＣＲ扩增。引物序列分别为：ＧＡＰＤＨ：上游：５＇－ＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣ－３＇，下游：５＇－ＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣ－３＇；ＩＢＡ－１：上游：５′－ＡＴＧＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＴＴ－３′，下游：５′－ＧＣＡＴＴＣＧＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡ－３′。
１．２．８ 免疫荧光染 大鼠腹腔注射过量的２％钠进行麻醉，麻醉后打开胸腔暴露心脏进行灌注，灌注溶液依次为２００ｍＬ的０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ７．４）和５００ｍＬ的４％多聚甲醛灌注液。手术取出脊髓Ｌ４至Ｌ６腰膨大处，然后依次进行４％多聚甲醛后固定，３０％蔗糖溶液脱水和切片，切片选择的厚度为３０μｍ，转至盛满０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ液中。使用０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ液漂洗３次，加入含胎牛血清的抗体封闭液封闭１ｈ，随后加入ＩＢＡ－１（１∶４００）一抗，室温孵育１ｈ，４℃过夜。使用０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ液漂洗３次，加入相应荧光二抗，避光孵育２ｈ。最后０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ液漂洗３次后，使用５０％甘油封片剂封片，激光共聚焦显微镜观察染情况。１．２．９ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 大鼠腹腔注射过量的２％钠麻醉后，断头处死取出腰膨大部分脊髓，然后加入１ｍＬ混有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的ＲＩＰＡ裂解液，匀浆裂解１０ｍｉｎ，离心取上清。依照ＢＣＡ蛋白定量试剂盒说明书
进行蛋白定量，使其终浓度为２μｇ／μＬ。制备ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶对蛋白样品进行电泳，依照蛋白Ｍａｒｋｅｒ确定ＩＢＡ－１和β－ａｃｔｉｎ的位置，然后用ＰＶＤＦ膜将凝胶进行转膜。转膜后，使用５％脱脂牛奶进行封闭，然后ＴＢＳＴ洗膜３×１０ｍｉｎ，孵育羊抗ＩＢＡ－１和小鼠抗β－ａｃｔｉｎ，４℃冰箱过夜。第二天ＴＢＳＴ洗膜３×１０ｍｉｎ，加入辣根过氧化物酶二抗，室温孵育８０ｍｉｎ。再次洗膜３×１０ｍｉｎ。最后滴加ＥＣＬ化学发光液，进行曝光成像，对条带进行灰度定量分析。
１．３ 实验流程
实验流程见图１
。
峰，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；而Ｓｈａｍ组和Ｎａ ｖｅ组相比，各时间点差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），如图２Ａ
。
图２ 唑来膦酸对骨癌痛大鼠痛行为学的影响
Ａ：骨癌痛大鼠痛行为学改变；Ｂ：单次给予唑来膦酸后骨癌痛大鼠痛行为学改变；Ｃ：持续给予唑来膦酸后骨癌痛大鼠痛行为学改变。
Ｐ＜０．０１，ｖｓＢＣＰ组。
Ｆｉｇ．２ ＡｎａｌｇｅｓｉｃｅｆｆｅｃｔｏｆＺＯＬｉｎｂｏｎｅｃａｎｃｅｒｐａｉｎｒａｔｓ
Ａ：Ｐａｉｎｂｅｈａｖｉｏｒｃｈａｎｇｅｓｉｎｂｏｎｅｃａｎｃｅｒｐａｉｎｒａｔｓ．Ｂ：ＰａｉｎｂｅｈａｖｉｏｒｃｈａｎｇｅｓａｆｔｅｒｓｉｎｇｌｅａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆＺＯＬｉｎｂｏｎｅｃａｎｃｅｒｐａｉｎｒａｔｓ．Ｃ：Ｐａｉｎｂｅ ｈａｖｉｏｒｃｈａｎｇｅｓａｆｔｅｒｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆＺＯＬｉｎｂｏｎｅｃａｎｃｅｒｐａｉｎｒａｔｓ． Ｐ＜０．０１，ａｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏＢＣＰｇｒｏｕｐ．
２．２ 单次给药后两种给药方式产生的镇痛效应比较由于骨癌痛大鼠术后１４天达到痛反应高峰，因此于此时间点进行药物干预。为了比较两种给药方式产生的镇痛效应，此部分实验分为８组：假手术组（Ｓｈａｍ组）、骨癌痛模型组（ＢＣＰ组）、鞘内注射低剂量唑来膦酸组（ｉ．ｔ．ｌ－ＺＯＬ＋ＢＣＰ组）、鞘内注射中剂量唑来膦酸组（ｉ．ｔ．ｍ－ＺＯＬ＋ＢＣＰ组）、鞘内注射高剂量唑来膦酸组（ｉ．ｔ．ｈ－ＺＯＬ＋ＢＣＰ组）、皮下注射低剂量唑来膦酸组（ｓ．ｃ．ｌ－ＺＯＬ＋ＢＣＰ组）、皮下注射中剂量唑来膦酸组（ｓ．ｃ．ｍ－ＺＯＬ＋ＢＣＰ组）、皮下注射高剂量唑来膦酸组（ｓ．ｃ．ｈ－ＺＯＬ＋ＢＣＰ组）。
鞘内给予不同剂量的唑来膦酸３０ｍｉｎ后，鞘内给药３组大鼠同ＢＣＰ组相比，立即出现镇痛效应，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；高剂量和中剂量两组同低剂量组各时间点相比，镇痛效应更强，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；高剂量组与中剂量组相比，镇痛效应无差异（Ｐ＞０．０５）。而皮下注射唑来膦酸后３０ｍｉｎ后，也出现类似镇痛效应，只是镇痛效应弱于鞘内注射，
如图２Ｂ。
２．３ 持续给药后两种给药方式产生的镇痛效应比较为了验证唑来膦酸持续给药的镇痛效应，我们选择在骨癌痛大鼠热缩足潜伏期最明显的术后１４ｄ进行干预试验。此部分实验分为４组：假手术组（Ｓｈａｍ组）、骨癌痛模型组（ＢＣＰ组）、鞘内注射唑来膦酸组（ｉ．ｔ．ＺＯＬ＋ＢＣＰ组）、皮下注射唑来膦酸组（ｓ．ｃ．ＺＯＬ＋ＢＣＰ组）。
ｉ．ｔ．ＺＯＬ＋ＢＣＰ组和ｓ．ｃ．ＺＯＬ＋ＢＣＰ组同ＢＣＰ组相比，均立即出现镇痛效应，并且可以持续一段时间，各时间点差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。ｉ．ｔ．ＺＯＬ＋ＢＣＰ组与ｓ．ｃ．ＺＯＬ＋ＢＣＰ组相比，鞘内给药镇痛效应更强，各时间点差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５），如图２Ｃ。
２．４ 两种给药方式对脊髓小胶质细胞活化的影响
ＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示，在给药第７天，ＢＣＰ组脊髓内ＩＢＡ－１ｍＲＮＡ和蛋白表达高于Ｓｈａｍ组，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。ｉ．ｔ．ＺＯＬ＋ＢＣＰ组ＩＢＡ－１ｍＲＮＡ和蛋白表达低于ＢＣＰ组，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），如图３－４。不同的是同ＢＣＰ组相比，ｓ．ｃ．ＺＯＬ＋ＢＣＰ组脊髓ＩＢＡ－１ｍＲＮＡ和蛋白表达无显著差异（Ｐ＞０．０５）。免疫荧光结果显示，ＢＣＰ组脊髓内ＩＢＡ－１同Ｓｈａｍ组相比出现广泛活
化，ｉ．ｔ．ＺＯＬ＋ＢＣＰ组脊髓小胶质细胞的活化被抑制，但ｓ．ｃ．ＺＯＬ＋ＢＣＰ组没有这样的效果，如图５
。
图３ 各组大鼠脊髓中ＩＢＡ－１ｍＲＮＡ的表达变化Ｆｉｇ．３ ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＢＡ－１ｍＲＮＡｉｎｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｏｆｒａｔｓｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ
２．５ 两种给药方式对运动功能和自发活动功能影响的比较旷场试验结果提示，给药两组平均活动速度和中央活动时间同Ｎａ ｖｅ组相比，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。转棒试验结果显示，给药两组停留时间同Ｎａ ｖｅ组相比，各时间点差异均无统计学意义（Ｐ＞０．０５），如图６。
３ 讨论
唑来膦酸属于临床上常用的第三代双膦酸盐类药物，目前主要用于实体肿瘤转移引起的骨痛，具体机制尚不清楚，但普遍认为其镇痛机制主要涉及以下３个方面：首先，抑制破骨细胞活动，诱导破骨细胞凋亡，从而减少骨质破坏减轻疼痛；其次，抑制肿瘤细胞和破骨细胞释放炎性介质和疼痛介质，而这些介质和疼痛关系密切；最后，在多项研究中表明，其具有抗肿瘤的作用。通过这三种方式共同减少外周伤害性刺激，减轻骨癌痛［１２－１３］。但其是否具有中枢镇痛效应，
·
８
７
３
·郭池华，等 唑来膦酸不同给药方式对骨癌痛大鼠镇痛作用的比较
女吉他手尚无定论。
本实验我们运用大鼠Ｗａｌｋｅｒ２５６乳腺癌细胞建立大鼠骨癌痛模型，采用鞘内注射和皮下注射两种给药方式，观察不同给药方式对骨癌痛大鼠痛行为学反应的影响。结果发现两种给药方式唑来膦
酸均立即表现出镇痛效应，并且具有一定的持续性，另外，从实验也可得出鞘内注射唑来膦酸的镇痛效应更强。我们在旷场实验和转棒实验中发现，无论鞘内注射还是皮下注射均不影响大鼠的运动功能和自发活动功能。这一点说明唑来膦酸作为中枢镇痛药物使用时，神经
毒副反应小。
图４ 各组大鼠脊髓中ＩＢＡ－１蛋白的表达变化
Ｆｉｇ．４ ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＢＡ－１ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｏｆｒａｔｓｉｎｅａｃｈｇｒｏｕ
ｐ郭池
图５ 免疫荧光染检测各组大鼠脊髓中ＩＢＡ－１的表达变化
Ｆｉｇ．５ ＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＢＡ－１ｉｎｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｏｆｒａｔｓｉｎｅａｃｈｇｒｏｕ
ｐ
图６ 唑来膦酸对各组大鼠运动功能的影响
Ａ：各组大鼠在旷场实验中平均活动速度的对比；Ｂ：各组大鼠在旷场实验中中央活动时间的对比；Ｃ：各组大鼠在转棒试验中棒上相对时间的对比。
Ｆｉｇ．６ ＥｆｆｅｃｔｏｆＺＯＬｏｎｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎａｎｄｍｏｔｏｒｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎｏｆｒａｔｓｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ
Ａ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅａｖｅｒａｇｅａｃｔｉｖｉｔｙｖｅｌｏｃｉｔｙｏｆｒａｔｓｉｎｏｐｅｎｆｉｅｌｄｔｅｓｔｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ．Ｂ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｃｅｎｔｅｒｔｉｍｅｏｆｒａｔｓｉｎｏｐｅｎｆｉｅｌｄｔｅｓｔｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ．Ｃ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆｒａｔｓｉｎｒｏｔａｒｏｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ．
随后我们进一步研究了两种给药方式镇痛效应不同的
机制。目前研究认为及我们前期研究发现疼痛的产生和维
持脊髓背角胶质细胞发挥了重要作用。当脊髓背角胶质细
胞被活化后，可产生大量疼痛相关介质，兴奋脊髓背角伤害
性感受神经元造成中枢敏化产生疼痛。其中胶质细胞在脊
髓中主要可以分为小胶质细胞和星形胶质细胞［１４－１５］。我们
4m3前期研究发现，在骨癌痛早期小胶质细胞最先被激活，然后
激活的小胶质细胞释放炎性介质活化星形胶质细胞，“小胶
质细胞－星形胶质细胞－神经元”形成活化环路维持骨癌
痛，这也是骨癌痛为什么难以的原因之一。由于小胶质
细胞的广泛活化早于星形胶质细胞，因此小胶质细胞在骨癌
痛的发生发展过程中的作用得到越来越多的关注［１６－１７］。本
研究发现，骨癌痛大鼠脊髓背角浅层小胶质细胞广泛活化，
表现为特异性标记物ＩＢＡ－１广泛增加。当鞘内注射唑来膦
·
９
７
３
·
西堤红山现代肿瘤医学 ２０２１年２月 第２９卷第０３期 ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｆｅｂ ２０２１，ＶＯＬ ２９，Ｎｏ ０３
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议