许伟华;刘冬霞;龙辉;胡新年;汤美芬
【摘 要】目的 探讨全自动毛细管血红蛋白电泳仪在异常血红蛋白筛查中的应用价值.方法 采用全自动毛细管血红蛋白电泳仪对我院12257位受检者进行血红蛋白电泳分析,收集异常血红蛋白标本,进行地中海贫血基因检测验证.结果 在检测的12257份标本中,共发现异常血红蛋白232例,包括血红蛋白H 64例、血红蛋白Bart's 42例、血红蛋白CS 60例、血红蛋白E 52例、血红蛋白K 25例、血红蛋白Q 8例、血红蛋白G 1例、血红蛋白J 2例、血红蛋白F异常增高(>10％)31例,异常血红蛋白发生率1.89％.研究发现部分异常血红蛋白合并α地中海贫血或β地中海贫血,这些异常血红蛋白需进一步进行基因测序.结论 毛细管血红蛋白电泳在各种常见的异常血红蛋白检出中有重要的应用价值. 【期刊名称】《实验与检验医学》
【年(卷),期】2018(036)002
【总页数】4页(P178-181)
【关键词】毛细管电泳;异常血红蛋白;基因检测
卡瓦
【作 者】许伟华;刘冬霞;龙辉;胡新年;汤美芬
【作者单位】清远市妇幼保健院优生与遗传实验诊断中心,广东 清远 511515;清远市妇幼保健院优生与遗传实验诊断中心,广东 清远 511515;清远市妇幼保健院优生与遗传实验诊断中心,广东 清远 511515;清远市妇幼保健院优生与遗传实验诊断中心,广东 清远 511515;清远市妇幼保健院优生与遗传实验诊断中心,广东 清远 511515
【正文语种】中 文
【中图分类】R446.11+9
血红蛋白病是一类由于血红蛋白（hemoglobin，Hb）结构异常或合成量不足而引起的遗传性血液病；地中海贫血是由于组成血红蛋白的珠蛋白链合成量不平衡而引起贫血；异常血红蛋白则是因为血红蛋白的珠蛋白链一级分子结构异常所引起的血红蛋白分子结构改变，如Hb S病、Hb E病等 [1]。目前已发现的异常血红蛋白有700多种，其中大多数是α链和β链的变异，并且以单个碱基的替代为主[2]。我国人中，多数类型的异常血红蛋白没有明显
的临床表现，但有少数异常血红蛋白单独（如Hb CS纯合子）存在或复合地中海贫血（如Hb E/β-地中海贫血）时，表现为中间型或重型地中海贫血。因此，在地贫的高发地区，异常血红蛋白的筛查及诊断十分重要。鉴定Hb的传统方法主要有醋酸纤维膜电泳、琼脂凝胶电泳等，但都操作过于繁琐，费时且检出率低。近几年发展起来的全自动毛细管电泳（CE）高度自动化，在地中海贫血筛查中有较好的敏感性和特异性，因此被广泛的应用临床实验室。
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伊春论坛在这项研究中，我们利用全自动毛细管电泳仪对12257例标本进行了血红蛋白分析，同时将筛查出的异常蛋白阳性标本进行了基因检测鉴定，旨在了解全自动毛细管血红蛋白电泳仪在异常血红蛋白筛查中的应用价值，现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 2016年1月至2016年12月在本院门诊及住院患者12257例，其中男性4902例，女性7355例，共检出异常血红蛋白标本232例，其中男性101例，女性 131例，年龄 14～44岁，平均年龄为29岁，并在知情同意情况下进行进一步地贫基因检测。
1.2 仪器与试剂
1.2.1 毛细管血红蛋白电泳 法国Sebia公司生产的Capillarys2全自动毛细管电泳仪及其配套血红蛋白电泳试剂盒CAPILLARYS HEMOGLOBIN(E)。
1.2.2 地贫基因检测 诊断试剂盒由深圳亚能公司提供，DNA提取为厦门至善全自动核酸提取仪Lab-Aid820及磁珠法DNA提取试剂，扩增仪为伯乐BIO RAD-100扩增系统；杂交仪为韩国fine PCR公司Combi H12杂交仪，电泳为DYY-8C型电泳仪。
1.3 方法
1.3.1 毛细管血红蛋白电泳 按照仪器操作说明书进行，标本用新鲜EDTA-K2抗凝全血无需洗涤、溶血和离心，直接装上样本架送入Capillarys2全自动毛细管电泳仪检测，约30min读取结果。
1.3.2 地贫基因检测 新鲜枸橼酸钠抗凝全血，DNA提取、扩增反应、gap-PCR检测缺失型α-地贫、RDB-PCR检测非缺失型α-地贫及β-地贫基因分析，操作程序严格按照SOP进行，检测中国人常见的 3 种缺失型 α-地贫：--SEA、-α3.7、-α4.2；3 种非缺失型 α-地贫 αCS、αQS、αWS； 以及 17 种β-地贫基因突变 CD41-42 （-TTCT）、IVSII-654（C→T）
、-29（A→G）、-28（A→G）、CD71-72（+A）、CD17（A→T）、CD43（G→T）、CD26（GAG→AAG）、CD27/28（+C）、CD31（-C）、-32（C→A）、-30（T→C）、CD14-15（+G）、IVS-I-1（G→A，G→T）、IVS-I-5（G→C）、Int（ATG→AGG）、CAP（A→C）。
2 结果
2.1 异常血红蛋白检测 在12257例样本中，共发现9种类型异常血红蛋白，共计232例，异常血红蛋白发生率1.89%，其中以Hb H、Hb CS、Hb E为主，分别为 64例、60例、52例，占比 27.59%、25.86%、22.41%。9种异常血红蛋白分布情况见表1，检出的各种异常血红蛋白电泳图谱见图1。
2.2 Hb H病的基因分析 筛查出的64例Hb H病例中，单纯Hb H 18例，Hb H合并Hb Bart’s有37例，Hb H合并Hb CS 7例，Hb H合并Hb CS及Hb Bart’s有2例。对其进行地贫基因检测，基因型分别为--SEA/-α3.7 35例、--SEA/-α4.2 18例、--SEA/α（QS）α 2例和--SEA/α（CS）α 9例。 64例Hb H病的地贫基因确诊分型情况见表2。
2.3 Hb CS的基因分析 检测出的60例Hb CS病例中，单纯CS带51例，H带合并CS带7例，H带合并CS带及Bart’s带有2例。对其进行地贫基因检测，结果为--SEA/α（CS） α 9 例、α（CS） α/αα 48例、α（CS） α/α（WS） α 1例以及 αα/αα 2例。60例Hb CS的地贫基因确诊分型情况见表3。
表1 232例异常血红蛋白患者异常血红蛋白分类及分布情况异常血红蛋白Hb H Hb H+Hb CS Hb CS Hb E Hb E+Hb G Hb E+Hb F(＞10%)Hb F(＞10%)Hb K Hb Q Hb J总数n 55 9 51 50 1 1 3 0 25 8 2 232百分率（%）23.71 3.88 21.98 21.55 0.43 0.43 12.93 10.78 3.45 0.83 100
图1 各种异常血红蛋白毛细管电泳图谱
表2 64例Hb H病的地贫基因确诊分型情况地贫基因分型--SEA/-α3.7--SEA/-α4.2--SEA/αQS α--SEA/αCS α总数n 35 18 2 9 6 4占H病百分率（%）54.69 28.13 3.13 14.05 100.00
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表3 60例Hb CS的地贫基因确诊分型情况地贫基因分型n 占Hb CS百分率（%）-SEA/αCS α915.00 αCS α/αα4880.00 αCS α/αWSα11.67 αα/αα23.33总数60100.00
2.4 其他异常血红蛋白分类及地贫基因确诊情况检出Hb E标本共52例，基因检测结果为βCD26/βN 51例，βCD26/β-28 1例，血红蛋白 E 病检出率100%。检出Hb Q标本8例，Q带常见于Z7区，同时在Z1区可见Hb A2变异体，地贫基因检测结果为-α4.2/αα，βN/βN， 提示异常血红蛋白 Q 合并-α4.2缺失。另外，检出Hb F异常增高（＞10%）及Hb K（K 带常见于 Z11 区）、Hb J（J带常见于 Z12区）、Hb G（G带常见于Z6区）常规地贫基因检测结果显示正常，需进一步进行罕见地贫检测，必要时进行基因测序才能检测出结果。其他异常血红蛋白分布情况及地贫基因检测结果见表4。
表4 其他异常血红蛋白分布及地贫基因检测结果异常血红蛋白Hb E+Hb G Hb E Hb E+Hb F(＞10%)Hb F(＞10%)Hb Q Hb K Hb J n 1 5 1 0 1 3 0 8 2 5 2基因结果 n βCD26/βN βCD26/βN βCD26/β-28 αα/αα，βN/βN-α4.2/αα，βN/βN αα/αα，βN/βN αα/αα，βN/βN 50 1 30 8 25 2
3 讨论
全自动毛细管电泳仪是近年来迅速发展起来应用于地贫筛查的工具，以其全自动、快速、高效、准确等优点得到广泛应用[3]，其原理主要是利用充满电泳液的石英毛细管中，以溶
血剂进行稀释的红细胞样品在高压电的作用下进行分离。当样品进入到毛细管中，无论是带正电、负电或不带电的粒子，都在电渗流的作用下，向阴极迁移。带电粒子的性质、数量及体积能够影响其在毛细管中的迁移速率，从而在电泳区域形成电泳图谱，Sebia Capillarys 2分析软件根据电泳速率划分为15个区域[4]，每个区域有数据库提示可能为何种血红蛋白变异体。因而，能快速的对所检测到的异常血红蛋白进行判断分析。
目前已发现的异常血红蛋白有700多种，在我国发现70多种，其中大多数为珠蛋白α链和β链的变异 [5]。在我国异常血红蛋白发生率为0.337%，具有高度的分布不均一性和遗传多态性，主要以南方地区为主，其中云南省最高，为5.93%，广东省为0.393%。在南方地区常见的异常血红蛋白主要为Hb E和Hb J，而北方则主要为Hb E和Hb D[6]。本研究利用毛细管血红蛋白分析系统共筛查了12257例样本，检出9种异常血红蛋白共232例，异常血红蛋白发生率1.89%。其中Hb H 64例、Hb CS 60例、Hb E 51例；发生率分别为：0.52%、0.49%、0.42%；诊断准确度分别为100%、96.67%、100%，诊断准确度与文献报道相近[7，8]。
Hb H病中α珠蛋白链的减少或缺乏使γ珠蛋白链和β珠蛋白链相对增多，多余的γ链聚合成 H
茶与诗b Bart’s（γ4），β 链则聚合成 Hb H（β4），毛细管血红蛋白电泳可检测出不同水平的Hb H、Hb Bart’s和 Hb CS，其中 Hb H 含量约为 0.18%～40%[9]。而传统的醋酸纤维薄膜电泳无法准确定量，且受主观因素影响大。本次筛查出的64例Hb H病样本基因检测表明，Hb H病主要以缺失型为主，且以--SEA/-α3.7（又称右缺失 RW）为主，占54.69%。非缺失型Hb H病比例较小，主要为--SEA/α（CS） α，占 14.05%。
Hb CS是α2-珠蛋白基因终止密码子CD142（UAA＞CAA）突变，降低mRNA稳定性而引起表达水平降低，是一种不稳定性Hb，常位于Z2区带，但不同时间解离后区带位置不同，纯合Hb CS，在电泳中定量为5%～8%，而杂合Hb CS含量很低，仅占0.5%～1%，在一般的醋酸纤维薄膜电泳中很难检出，但在全自动电泳系统中可以检出[10，11]。本研究中共检测出60例Hb CS，地贫基因检测结果有58例为αCS α携带者，有2例未发现异常，其原因可能与不稳定血红蛋白降解有关。
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