井冈山大学学报(自然科学版) 89 文章编号：1674-8085(2021)01-0089-05
病毒肺炎(COVID-19)的作用机制
马 颖1，张 凤2，王 亮3，*王博龙
1
（1.宜春学院化学与生物工程学院，江西，宜春 336000；2.海军军医大学附属长征医院药材科，上海 200003；
3.上海中医药大学中药研究所，上海 201203）
摘 要：目的 基于网络药理学方法研究连花清瘟胶囊活性成分防治新型冠状病毒肺炎的作用机制。方法 通过文献挖掘确定连花清瘟胶囊活性成分，依托TCMSP 、Swiss Target Prediction 数据库检索活性成分靶点，利用Cytoscape3.6.1软件绘制连花清瘟胶囊活性成分-靶点网络；运用GeneCards 数据库查询新型冠状病毒肺炎靶点，将其与连花清瘟胶囊活性成分靶点相互映射，筛选出共同靶点。应用STRING 平台构建靶蛋白相互作用网络并提取关键靶点，对关键靶点进行GO （Gene Ontology ）基因功能和通路 分析。结果 连花清瘟胶囊24个活性成分作用于33个新型冠状病毒肺炎靶点，其中NOS2与血管紧张素转化酶II （ACE2）共表达；TNF 、TP53、IL6、CASP3、IL2、MAPK14、RELA 共7个关键靶基因参与免疫系统过程、多细胞生物过程、解毒过程、刺激反应、抗氧化活性等生物过程及功能，调控百日咳、南美锥虫病、乙型肝炎、、甲型流感、EB 病毒感染、单纯疱疹病毒感染、PI3K-Akt 、TNF 、MAPK 、T 细胞受体等信号通路。结论 连花清瘟胶囊对SARS-CoV-2入侵人体受体ACE2具有一定的阻断作用，同时发挥抑制机体炎症风暴、调节机体免疫的作用。 关键词：连花清瘟胶囊；活性成分；新型冠状病毒肺炎；网络药理学；基因共表达
中图分类号：R563.1+4 文献标识码：A DOI:10.3969/j.issn.1674-8085.2021.01.015
TO EXPLORE THE MECHANISM OF LIANHUA QINGWEN CAPSULE IN THE PREVENTION AND TREATMENT OF COVID-19 BASED ON
NETWORK PHARMACOLOGY
MA Ying 1，ZHANG Feng 2，WANG Liang 3，*WANG Bo-long 1
（1. School of Chemical and Biological Engineering,Yichun University, Yichun, Jiangxi 336000, China; 2. Department of Medicine, Changzheng Hospital, Naval Medical University, Shanghai 200003, China;
3. Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China ）
Abstract Objective: To investigate the mechanism of active constituents of Lianhua Qingwen capsule in the prevention and treatment of Novel Coronavious Pneumonica based on network pharmacology. Methods: Active constituents of Lianhua Qingwen capsule were determined by literature mining, and targets of active constituents were retrieved based on TCMSP and Swiss Target Prediction database. Cytoscape3.6.1 software was used to draw the network of active constituents-targets. GeneCards database was used to query targets of Novel Coronavious Pneumonica, and targets of its active components of Lianhua Qingwen capsule were mapped to each other to screen out common targets. Using STRING platform to construct target genes interaction network and extract key
第42卷第1期 V ol.42 No.1 井冈山大学学报(自然科学版) 2021年1月 Jan. 2021 Journal of Jinggangshan University (Natural Science) 89
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收稿日期：2020-09-18；修改日期：2020-11-12
作者简介：马 颖(1996-)，女，江西九江人，硕士生，主要从事临床药学研究(E-mail:*****************);
张 凤(1985-)，女，四川成都人，副主任药师，博士，主要从事临床药学与系统生物学(E-mail:**********************)；王 亮(1988-)，男，上海人，博士生，主要从事中药注射剂代谢和中药化学(E-mail:151****************);*
王博龙(1977-)，男，陕西扶风人，副教授，博士，硕士生导师，主要从事药物临床前药理研究及临床有效性与安全性评价 (E-mail ：****************）.
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targets, so as to analyze the GO（Gene Ontology）gene function and pathway of key targets. Results: 24 active constituents of Lianhua Qingwen capsule acted on 33 targets of Novel Coronavious Pneumonica, among which NOS2 was co-expressed with angiotensin-converting enzyme II. TNF, TP53, IL6, CASP3 IL2, MAPK14 and RELA, a total of seven key target genes involved in the immune system process, multicellular organisms, detoxification process, stimulus-response, antioxidant activity and other biological processes and functions; regulating Pertussis, Cha
gas disease, Hepatitis B, Tuberculosi, Influenza A, Epstein-Barr virus infection, Herpes simplex infection n, PI3K-Akt signaling pathway, TNF signaling pathway, MAPK signaling pathway, T cell receptor signaling pathway and other signaling pathways. Conclusions: Lianhua Qingwen capsule had a certain blocking effect on the invasion of human receptor ACE2 by SARS-CoV-2, at the same time, which played a role in inhibiting inflammatory storm and regulating the body's immunity.
Key words:Lianhua Qingwen capsule; active constituents; COVID-19; network pharmacology; gene coexpression
新型冠状病毒肺炎又称COVID-19（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）[1-2]，是由SARS-CoV-2病毒经呼吸道飞沫和接触传播的呼吸系统烈性传染病。截至2020年4月22日15时20分，SARS-CoV-2病毒已扩散到200多个国家和地区，已导致全球256万人感染，17万余人死亡，成为全球范围内的突发公共卫生事件。COVID-19以发热、干咳、乏力为主要表现，少数伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等，重症患者多在发病1周后出现呼吸困难和（或）低氧血症，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等[3]。对于COVID-19的目前尚无特效药物，国内外的科研人员都在夜以继日开展抗COVID-19药物及疫苗研究，但短时间内不可能获得安全有效的药物或疫苗。
中药具有多成分、多靶点、整体作用的特点，在COVID-19的预防和中具有很大的潜力。此次新冠疫情发生以来，国家卫健委和国家中医药管理局联合发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第4版、第5版、第6版）》，以及北京、山东、河北、广东、上海等省市发布的诊疗方案都将连花清瘟胶囊作为推荐用药[4]。虽然王林[5]、王法财[6]等应用网络药理学方法分析了连花清瘟胶囊COVID-19的分子机制，但他们都是基于口服生物利用度、类药性等参数来选择药效成分开展研究。基于口服中药药效成分必须入血的血清药物化学思维[7]，以及于华等[8]研究了连花清瘟胶囊的入血成分，再结合具有镇咳平喘之功效的麻黄活性成分麻黄碱和[9-10]，本研究最终以大黄素、芒柄花黄素、芦丁、没食子酸、甘草素、金丝桃苷等24种活性成分为药效物质，借助网络药理学方法与技术，全面分析连花清瘟胶囊的作用靶点、生物过程及信号通路，旨在详细阐明其防治COVID-19的复杂机理。
1 材料与方法
1.1 数据库和软件
（1）活性成分-靶点数据库：中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP（ibts.hkbu.edu.hk/ LSP/tcmsp.php），SwissTarget Prediction(www. swisstargetprediction.ch/)。（2）蛋白质数据库：UniProt (/)，PubChem（ bi.v/）。（3）疾病-靶点数据库：GeneCards（/）。（4）蛋白质相互作用分析平台：STRI
NG（/）。（5）生信在线分析平台：ensembl网站（sembl. org/biomart），OmicShare云平台（omicshare. com/），DA VID 6.8（david. ncifcrf. gov/）。（6）网络分析及作图软件：Cytoscape 3.6.1，Venny 2.1.0（bioinfogpcnb.csic.es/tools/ venny/index.html）。
1.2 连花清瘟胶囊活性成分靶点及成分-靶点网络
构建
本研究以连花清瘟胶囊24种活性成分为对象，运用PubChem数据库搜索活性成分标准的Canonical SMILES格式，将SMILES格式文件导入
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SwissTargetPrediction平台，进行靶点预测，并将TCMSP中相应化合物的靶点作为补充；运用UniProt数据库将靶点统一转换为基因名称保存，将以上两个来源的基因合并，构建连花清瘟胶囊靶基因汇总；利用Cytoscape3.6.1软件构建连花清瘟胶囊“活性成分-靶点网络”。
1.3 连花清瘟胶囊COVID-19作用靶标的获
取与分析阿彻他的奋斗
基于Gene Cards数据库，以“Novel coronavirus pneumonia”为关键词检索与COVID-19相关的作用靶点，将连花清瘟胶囊的预测靶点与COVID-19相关作用靶点相互映射，筛选出共同靶点，得到连花清瘟胶囊COVID-19的作用靶点；并将得到的作用靶点进行基因共表达分析。
1.4 PPI网络的构建和核心靶点的筛选
为研究靶点之间的相互作用，将筛选出的共同靶点导入STRING网络平台，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值为“medium confidence”，其余参数均保持默认值，结果保存为TSV格式并导入Cytoscape3.6.1软件；运用其插件“Network Analyze”分析网络拓扑参数，以节点度值(Degree)、介数（Betweenness）、最短路径（Clossness）均超过平均值为标准筛选出关键靶点。
1.5 关键靶点基因本体GO分析
将关键靶点的名称在ensembl网站转换为相应的基因ID后，运用OmicShare云平台进行动态GO 富集分析，利用平台候选背景基因，选择“Homo sapiens(智人）”，其中GO功能分析包括生物过程（Biological Process）、分子功能（Molecular Function）和细胞组成（Cellular Component）。
1.6 关键靶点KEGG信号通路富集
利用DA VID 6.8对关键靶点进行KEGG信号通路富集，物种与背景设置均为“Homo sapiens”，设定阈
值P-value<0.01，研究关键靶基因富集的信号通路，并对富集通路进行可视化分析。
2 结果
2.1 连花清瘟胶囊活性成分靶点及成分-靶点网络
构建
查阅文献[8-10]发现连花清瘟胶囊中主要有大黄素、芒柄花黄素、芦丁、没食子酸、甘草素、金丝桃苷、麻黄碱、、红景天苷、马钱苷酸、苦杏仁苷、大黄酸、断氧化马钱苷、新绿原酸、绿原酸、大黄素-8-O-葡萄糖苷、连翘酯苷E、隐绿原酸等24种活性成分，详见表1。在TCMSP数据库得到连花清瘟胶囊活性成分靶基因92个（筛除重复），在SwissTarget Prediction服务器获取连花清瘟胶囊活性成分靶基因152个（筛除重复），两者合并删除重复后共得到预测的活性成分靶基因220个。将连花清瘟胶囊活性成分与对应的靶标导入Cytoscape3.6.1软件中，构建“活性成分-靶点”网络图，如图1所示，连花清瘟胶囊24种活性成分作用于220个靶基因的网状图，图中244个节点，510条线充分体现了连花清瘟胶囊多成分、多靶点的药理作用。
表1 连花清瘟胶囊活性成分基本信息Table 1 Active ingredients basic information of Lianhua
Qingwen capsule
活性成分英文名化学式
PubChem
CID 中药
没食子酸Gallic acid C7H6O5370 大黄、红景天
新绿原酸Neochlorogenic acid C16H18O95280633 金银花、鱼腥草红景天苷Salidroside C14H20O7159278 连翘
连翘酯苷E Forsythoside E C20H30O1269634125 连翘
马钱苷酸Loganic acid C16H24O1089640 金银花
绿原酸Chlorogenic acid C16H18O91794427
金银花、苦杏仁、
鱼腥草
隐绿原酸
Cryptochlorogenic
acid
C16H18O99798666 金银花
苦杏仁苷Amygdalin
C20H27NO1
1
656516 苦杏仁
獐牙菜苷Sweroside C16H22O9161036 金银花
断氧化马
钱苷
Secoxyloganin C17H24O11162868 金银花
芦丁Rutin C27H30O165280805
连翘、甘草、金银
花、麻黄、鱼腥草金丝桃苷Hyperoside C21H20O125281643
广藿香、金银花、
连翘、鱼腥草
芹糖甘草
苷
Liquiritin apioside C26H30O1310076238 甘草
芹糖异甘
草苷
isoliquiritin apioside C26H30O136442433 甘草
异甘草苷Isoliquiritin C21H22O95318591 甘草
甘草素Liquiritigenin C15H12O4114829 板蓝根、甘草
大黄素
-8-O-葡萄再生实验
糖苷
Emodin-8-glucoside C21H20O1099649 板蓝根
大黄酚葡
萄糖苷
Chrysophanol
glucoside
C21H20O96324923 大黄
芒柄花黄
素
Formononetin C16H12O45280378 甘草
大黄酸Rhein C15H8O610168 大黄
大黄素Emodin C15H10O53220
大黄、板蓝根、薄
荷
甘草酸Glycyrrhizic acid C42H62O1614982 甘草、苦杏仁
麻黄碱Ephedrine C10H15NO 9294 麻黄
Pseudoephedrine C10H15NO 7028 麻黄
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图1 “活性成分-靶点”网络
Fig.1 The network of “ active ingredients-targets ”
2.2 连花清瘟胶囊COVID-19的靶标预测
以“new coronavirus pneumonia ”为关键词，在GeneCards 数据库中收集COVID-19的相关作用靶点，将连花清瘟胶囊的预测靶点与COVID-19的相关作用靶点相互映射，得到连花清瘟胶囊COVID-19的潜在作用靶点33个，详见图2。
由于ACE2是SARS-CoV-2侵入人体的重要受体[11]，将连花清瘟胶囊COVID-19的33个潜在靶标与ACE2进行共表达分析。结果显示，ACE2与NOS2存在共表达（图3），说明连花清瘟胶囊有可能通过NOS2来影响ACE2表达，从而发挥阻断病毒入侵效应。
图2 连花清瘟胶囊靶标与COVID-19靶标的韦恩图 Fig. 2 Venn diagram of Lianhua Qingwen capsule targets and
COVID-19 targets
网络炒汇图3 ACE2与连花清瘟胶囊COVID-19潜在靶点的
共表达情况
Fig.3 Co-expression of ACE2 and potential targets of Lianhua
Qingwen capsule in treatment of COVID-19
2.4 关联网络构建与关键靶基因筛选
如图4所示，将筛选出的33个COVID-19的潜在靶标输入STRING 数据库，获取蛋白相互作用关系，共有32个节点（1个靶基因未参与）、201
条相互作用连线构成关联网络，图中节点的大小代表度值（degree ）大小，节点越大代表度值越大；节点边的粗细代表介数（betweenness ）大小，边线的越粗代表介数越大，节点边的颜代表平均最短路径（Closeness ）大小，颜越深代表数值越大。PPI 关联网络的平均度值为12.56，平均介数为2.18×10-2，平均最短路径（Closeness ）为6.24×10-1，其中共有7个基因参数在平均值之上，为网络中连花清瘟胶囊COVID-19的关键靶点，见表2。
图4 连花清瘟胶囊潜在靶基因关联网络
Fig.4 The association network of potential genes of Lianhua Qingwen
capsule
表2 连花清瘟胶囊COVID-19的关键靶标 Table 2 Key targets of Lianhua Qingwen capsule for COVID-19 靶点 degree betweeness clossness TNF 24 1.43×10-1 8.16×10-1 TP53 23 7.78×10-2 7.95×10-1 CASP3 23 6.64×10-2 7.95×10-1 IL6 23 7.65×10-2 7.95×10-1 MAPK14 21 5.74×10-2 7.56×10-1 IL2 20 6.33×10-2 7.38×10-1 RELA
18
2.95×10-2
7.05×10-1
2.5 连花清瘟胶囊关键靶点GO 功能富集分析
利用OmicShare 云平台对7个关键靶标进行
GO 功能与富集分析，结果显示生物过程（Biology Process ，BP ）主要涉及免疫系统过程、解毒、
多细胞生物过程、刺激反应、细胞增殖、生物过程的调节等；分子功能（Molecular Function ，MF ）及细胞组成（Cellular Componet ，CC ）主要涉及催化活性、
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苏门答腊小矮人
转录调节活性、细胞膜、细胞突触、细胞器等，详
见图5。进一步富集发现连花清瘟胶囊可能是通过
肺癌细胞对尼古丁反应的负调控、血液微粒形成的
正调控、超氧化物自由基清除的正调控、慢性炎症
反应抗原刺激的负调控，调节生物合成与代谢过
程，调控白细胞粘附、细胞因子分泌参与免疫应答，
调
图6 靶基因的GO富集分析
Fig. 6 GO enrichment analysis of target genes
2.6 连花清瘟胶囊关键靶点KEGG信号通路分析
依据P-value＜0.01筛选7个关键靶点的KEGG行波进位加法器
通路，共得到百日咳（Pertussis）、南美锥虫病
（Chagas disease）、乙型肝炎（Hepatitis B）、肺结
核（Tuberculosis）、甲型流感（Influenza A）、EB病
毒感染（Epstein-Barr virus infection）、单纯疱疹病
毒感染（Herpes simplex infection）、PI3K-Akt信号
通路（PI3K-Akt signaling pathway）、肿瘤坏死因子
信号通路（TNF signaling pathway）、MAPK信号通
路（MAPK signaling pathway）、Toll样受体信号通
有毒胶囊路（Toll-like receptor signaling pathway）、类节点受
体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway）、
T细胞受体通路（T cell receptor signaling pathway）
等35条信号通路。图7为上述前30条信号通路的
高级气泡图，以富集因子(Rich Factor，RF，即目标
基因中属于这个pathway的基因的数量/背景基因集
中这个pathway所有基因的数量)、P 值以及调控通
路上的基因个数来衡量KEGG富集程度，其中气泡
颜代表P值的大小，RF代表富集的程度大小，
气泡大小代表该通路中目标基因的多少。由图可见
P值偏小的是百日咳、南美锥虫病、肿瘤坏死因子
信号通路、乙型肝炎、、单纯疱疹病毒感染，
RF较高的是移植物抗宿主病、百日咳，类节点受
体、肿瘤坏死因子、T细胞受体信号通路；而目标
基因较多的是单纯疱疹病毒感染、MAPK信号通
路、HTLV-I感染。
图7 连花清瘟胶囊关键靶标的KEGG通路富集分析
Fig. 7 KEGG pathway enrichment analysis of key targets of Lianhua
Qingwen capsule 细胞组成涉及靶标数
分子功能涉及靶标数
生物过程涉及靶标数
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