第四法 酶联免疫吸附筛查法
1. 原理
试样中的黄曲霉毒素B1用甲醇水溶液提取，经均质、涡旋、离心(过滤b1)等处理获取上清液。被辣根过氧化物酶标记或固定在反应孔中的黄曲霉毒素B1，与试样上清液或标准品中的黄曲霉毒素B1竞争性结合特异性抗体。在洗涤后加入相应显剂显，经无机酸终止反应，于450 nm或630 nm波长下检测。样品中的黄曲霉毒素B1与吸光度在一定浓度范围内呈反比。 北漂族2. 注意
所用商品化的试剂盒需按照7中所述方法验证合格后方可使用。实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。储藏条件:试剂盒于2-8℃保存，避免冷冻。 保质期:该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。
3. 仪器和设备
3.1. 微孔板酶标仪：带450 nm与630 nm(可选)滤光片。
3.2. 均质器。
3.3. 移液管。
3.4. 电子天平：感量0.01 g
3.5. 离心机：转速≥6000 r/min江苏经贸职业技术学院学报。
3.6. 甲醇。
3.7. 50 mL离心管
4. 分析步骤
4.1 前处理
4.1.1 配液：样品提取液=70%甲醇。即V(甲醇):V(去离子水)=7：3。
4.1.2 制样：称取2g粉碎样品于50 mL离心管中，加5 mL样品提取液，振荡5 min，室温4000 r/min离心10 min。
4.2 样品检测
将所需试剂从4 ℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30 min以上，洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入白封袋，保存于2-8 ℃。
实验开始前，用去离了水将20 X浓缩洗涤液按20倍稀释成工作洗涤液。
编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
加样反应：加标准品或样本50 μL/孔到各白的微孔中，然后加酶标记物50μL /孔，再加入50μL /孔的抗体工作液，用盖板膜封板，轻轻振荡5 s混匀，25 ℃反应30 min。
洗涤：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用工作洗涤液25 μL /孔充分洗涤5次，每次问隔30 s，用吸水纸拍干(拍干后未清除的气泡可用干净头刺破)。
显：每孔加入底物液A 50μL，再加底物液B 50μL，轻轻振荡5 s混匀，25 ℃避光显15 min。
卷积核终止：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，终止反应。
测吸光值：用酶标仪于450 nm处测定每孔吸光度值(建议用双波长450/630 nm ) 。测定应在终止反应后10 min内完成。
5. 分析结果的表述
5.1 百分吸光率的计算
标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准液(0ppb)的吸光度值，再乘以100%，即。
·····················（1）
式中:测针
A——标准溶液或样本溶液的平均吸光度值；
A0——0ppb标准溶液的平均吸光度值;
5.2 酶联免疫试剂盒定量检测的标准工作曲线绘制
以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度(ppb)的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。
precis
6. 精密度
每个试样称取两份进行平行测定，以其算术平均值为分析结果。其分析结果的相对相差应不大于20%。
7. 其他
选取小麦粉或其他阴性样品，根据所购酶联免疫试剂盒的检出限，在阴性基质中添加3个浓度水平的AFT B1标准溶液(2 μg/kg、5 μg /kg、10μg /kg)。按照说明书操作方法，用读数仪读数，做三次平行实验。针对每个加标浓度，回收率在50%~120%容许范围内的该批次产品方可使用。
注：当试剂盒用于特殊膳食用食品基质检测时，需根据其限量，考察添加浓度水平为0.2 μg/kg AFT B1标准溶液的回收率。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议