食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定
1范围
本标准规定了食品中黄曲霉毒素B1㊁黄曲霉毒素B2㊁黄曲霉毒素G1㊁黄曲霉毒素G2(以下简称A F TB1㊁A F TB2㊁A F T G1和A F T G2)的测定方法㊂
本标准第一法为同位素稀释液相谱-串联质谱法，适用于谷物及其制品㊁豆类及其制品㊁坚果及籽类㊁油脂及其制品㊁调味品㊁婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中A F TB1㊁A F TB2㊁A F TG1和A F TG2的测定㊂
本标准第二法为高效液相谱-柱前衍生法，适用于谷物及其制品㊁豆类及其制品㊁坚果及籽类㊁油脂及其制品㊁调味品㊁婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中A F T B1㊁A F T B2㊁A F T G1和A F T G2的测定㊂
本标准第三法为高效液相谱-柱后衍生法，适用于谷物及其制品㊁豆类及其制品㊁坚果及籽类㊁油脂及其制品㊁调味品㊁婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中A F T B1㊁A F T B2㊁A F T G1和A F T G2的测定㊂
本标准第四法为酶联免疫吸附筛查法，适用于谷物及其制品㊁豆类及其制品㊁坚果及籽类㊁油脂及其制品㊁调味品㊁婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中A F TB1的测定㊂
本标准第五法为薄层谱法，适用于谷物及其制品㊁豆类及其制品㊁坚果及籽类㊁油脂及其制品㊁调味品中A F TB1的测定㊂
第一法同位素稀释液相谱-串联质谱法
2原理
试样中的黄曲霉毒素B1㊁黄曲霉毒素B2㊁黄曲霉毒素G1㊁黄曲霉毒素G2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液提取，提取液用含1%T r i t o nX-100(或吐温-20)的磷酸盐缓冲溶液稀释后(必要时经黄曲霉毒素固相净化柱初步净化)，通过免疫亲和柱净化和富集，净化液浓缩㊁定容和过滤后经液相谱分离，串联质谱检测，同位素内标法定量㊂ 3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为G B/T6682规定的一级水㊂
3.1试剂
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3.1.1乙腈(C H3C N)：谱纯㊂
3.1.2甲醇(C H3O H)：谱纯㊂
3.1.3乙酸铵(C H3C O O N H4)：谱纯㊂
3.1.4氯化钠(N a C l)㊂
3.1.5磷酸氢二钠(N a2H P O4)㊂
3.1.6磷酸二氢钾(K H2P O4)㊂
3.1.7氯化钾(K C l)㊂
3.1.8盐酸(H C l)㊂
3.1.9 T r i t o nX-100[C14H22O(C2H4O)n](或吐温-20,C58H114O26)㊂
3.2试剂配制
3.2.1乙酸铵溶液(5mm o l/L)：称取0.39g乙酸铵，用水溶解后稀释至1000m L，混匀㊂
3.2.2乙腈-水溶液(84+16)：取840m L乙腈加入160m L水，混匀㊂
3.2.3甲醇-水溶液(70+30)：取700m L甲醇加入300m L水，混匀㊂
3.2.4乙腈-水溶液(50+50)：取50m L乙腈加入50m L水，混匀㊂
3.2.5乙腈-甲醇溶液(50+50)：取50m L乙腈加入50m L甲醇，混匀㊂
3.2.610%盐酸溶液：取1m L盐酸，用纯水稀释至10m L，混匀㊂
3.2.7磷酸盐缓冲溶液(以下简称P B S)：称取8.00g氯化钠㊁1.20g磷酸氢二钠(或2.92g十二水磷酸氢二钠)㊁0.20g磷酸二氢钾㊁0.20g氯化钾，用900m L水溶解，用盐酸调节p H至7.4ʃ0.1，加水稀释至1000m L㊂
3.2.81%T r i t o nX-100(或吐温-20)的P B S：取10m LT r i t o nX-100(或吐温-20)，用P B S稀释至1000m L㊂3.3标准品
3.3.1 A F TB1标准品(C17H12O6,C A S:1162-65-8)：纯度ȡ98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质㊂
3.3.2 A F TB2标准品(C17H14O6,C A S:7220-81-7)：纯度ȡ98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质㊂
3.3.3 A F T G1标准品(C17H12O7,C A S:1165-39-5)：纯度ȡ98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质㊂
3.3.4 A F T G2标准品(C17H14O7,C A S:7241-98-7)：纯度ȡ98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质㊂
3.3.5同位素内标13C17-A F TB1(C17H12O6,C A S:157449-45-0)：纯度ȡ98%，浓度为0.5μg/m L㊂3.3.6同位素内标13C17-A F TB2(C17H14O6,C A S:157470-98-8)：纯度ȡ98%，浓度为0.5μg/m L㊂3.3.7同位素内标13C17-A F T G1(C17H12O7,C A S:157444-07-9)：纯度ȡ98%，浓度为0.5μg/m L㊂3.3.8同位素内标13C17-A F T G2(C17H14O7,C A S:157462-49-7)：纯度ȡ98%，浓度为0.5μg/m L㊂
注：标准物质可以使用满足溯源要求的商品化标准溶液㊂证券公司监督管理条例
3.4标准溶液配制
3.4.1标准储备溶液(10μg/m L)：分别称取A F TB1㊁A F TB2㊁A F TG1和A F TG21m g(精确至0.01m g)，用乙腈溶解并定容至100m L㊂此溶液浓度约为10μg/m L㊂溶液转移至试剂瓶中后，在-20ħ下避光
保存，备用㊂临用前进行浓度校准(校准方法参见附录A)㊂
3.4.2混合标准工作液(100n g/m L)：准确移取混合标准储备溶液(1.0μg/m L)1.00m L至100m L容量瓶中，乙腈定容㊂此溶液密封后避光-20ħ下保存，三个月有效㊂
3.4.3混合同位素内标工作液(100n g/m L)：准确移取0.5μg/m L13C17-A F TB1㊁13C17-A F TB2㊁13C17-
A F T G1和13C17-A F T G2各2.00m L，用乙腈定容至10m L㊂在-20ħ下避光保存，备用㊂
3.4.4标准系列工作溶液：准确移取混合标准工作液(100n g/m L)10μL㊁50μL㊁100μL㊁200μL㊁500μL㊁800μL㊁1000μL至10m L容量瓶中，加入200μL100n g/m L的同位素内标工作液，用初始流动相定容至刻度，配制浓度点为0.1n g/m L㊁0.5n g/m L㊁1.0n g/m L㊁2.0n g/m L㊁5.0n g/m L㊁8.0n g/m L㊁
10.0n g/m L的系列标准溶液㊂
4仪器和设备
4.1匀浆机㊂
4.2高速粉碎机㊂
4.3组织捣碎机㊂
4.4超声波/涡旋振荡器或摇床㊂
4.5天平：感量0.01g和0.00001g㊂
4.6涡旋混合器㊂
4.7高速均质器：转速6500r/m i n~24000r/m i n㊂
4.8离心机：转速ȡ6000r/m i n㊂
4.9玻璃纤维滤纸：快速㊁高载量㊁液体中颗粒保留1.6μm㊂
4.10固相萃取装置(带真空泵)㊂
4.11氮吹仪㊂
4.12液相谱-串联质谱仪：带电喷雾离子源㊂
4.13液相谱柱㊂
4.14免疫亲和柱:A F TB1柱容量ȡ200n g,A F TB1柱回收率ȡ80%,A F TG2的交叉反应率ȡ80%(验证方法参见附录B)㊂
注：对于不同批次的亲和柱在使用前需进行质量验证㊂
4.15黄曲霉毒素专用型固相萃取净化柱或功能相当的固相萃取柱(以下简称净化柱)：对复杂基质样品测定时使用㊂ 4.16微孔滤头：带0.22μm微孔滤膜(所选用滤膜应采用标准溶液检验确认无吸附现象，方可使用)㊂4.17筛网:1mm~2mm试验筛孔径㊂
4.18p H计㊂
5分析步骤
使用不同厂商的免疫亲和柱，在样品上样㊁淋洗和洗脱的操作方面可能会略有不同，应该按照供应商所提供的操作说明书要求进行操作㊂
警示：整个分析操作过程应在指定区域内进行㊂该区域应避光(直射阳光)㊁具备相对独立的操作台和废弃物存放装置㊂在整个实验过程中，操作者应按照接触剧毒物的要求采取相应的保护措施㊂
5.1样品制备
5.1.1液体样品(植物油㊁酱油㊁醋等)
采样量需大于1L，对于袋装㊁瓶装等包装样品需至少采集3个包装(同一批次或号)，将所有液体样品在一个容器中用匀浆机混匀后，其中任意的100g(m L)样品进行检测㊂
5.1.2固体样品(谷物及其制品㊁坚果及籽类㊁婴幼儿谷类辅助食品等)
采样量需大于1k g，用高速粉碎机将其粉碎，过筛，使其粒径小于2mm孔径试验筛，混合均匀后缩分至100g，储存于样品瓶中，密封保存，供检测用㊂
5.1.3半流体(腐乳㊁豆豉等)
采样量需大于1k g(L)，对于袋装㊁瓶装等包装样品需至少采集3个包装(同一批次或号)，用组织
捣碎机捣碎混匀后，储存于样品瓶中，密封保存，供检测用㊂
5.2样品提取
5.2.1液体样品
5.2.1.1植物油脂
称取5g试样(精确至0.01g)于50m L离心管中，加入100μL同位素内标工作液(3.4.3)振荡混合后静置30m i n㊂加入20m L乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30)，涡旋混匀，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20m i n(或用均质器均质3m i n)，在6000r/m i n下离心10m i n，取上清液备用㊂5.2.1.2酱油㊁醋
称取5g试样(精确至0.01g)于50m L离心管中，加入125μL同位素内标工作液振荡混合后静置30m i n㊂用乙腈或甲醇定容至25m L(精确至0.1m L)，涡旋混匀，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20m i n(或用均质器均质3m i n)，在6000r/m i n下离心10m i n(或均质后玻璃纤维滤纸过滤)，取上清液备用㊂
顶真联5.2.2固体样品
5.2.2.1一般固体样品
称取5g试样(精确至0.01g)于50m L离心管中，加入100μL同位素内标工作液振荡混合后静置30m i n㊂加入20.0m L乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30)，涡旋混匀，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20m i n(或用均质器均质3m i n)，在6000r/m i n下离心10m i n(或均质后玻璃纤维滤纸过滤)，取上清液备用㊂
5.2.2.2婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品
称取5g试样(精确至0.01g)于50m L离心管中，加入100μL同位素内标工作液振荡混合后静置30m i n㊂加入20.0m L乙腈-水溶液(50+50)或甲醇-水溶液(70+30)，涡旋混匀，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20m i n(或用均质器均质3m i n)，在6000r/m i n下离心10m i n(或均质后玻璃纤维滤纸过滤)，取上清液备用㊂
5.2.3半流体样品
称取5g试样(精确至0.01g)于50m L离心管中，加入100μL同位素内标工作液振荡混合后静置30m i n㊂加入20.0m L乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30)，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20m i n(或用均质器均质3m i n)，在6000r/m i n下离心10m i n(或均质后玻璃纤维滤纸过滤)，取上清液备用㊂
5.3样品净化
5.3.1免疫亲和柱净化
5.3.1.1上样液的准备
准确移取4m L上清液，加入46m L1%T r i t i o nX-100(或吐温-20)的P B S(使用甲醇-水溶液提取时可减半加入)，混匀㊂
5.3.1.2免疫亲和柱的准备
将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温㊂
5.3.1.3试样的净化
待免疫亲和柱内原有液体流尽后，将上述样液移至50m L注射器筒中，调节下滴速度，控制样液以1m L/m i n~3m L/m i n的速度稳定下滴㊂待样液滴完后，往注射器筒内加入2ˑ10m L水，以稳定流速淋洗免疫亲和柱㊂待水滴完后，用真空泵抽干亲和柱㊂脱离真空系统，在亲和柱下部放置10m L刻度试管，取下50m L的注射器筒，加入2ˑ1m L甲醇洗脱亲和柱，控制1m L/m i n~3m L/m i n的速度下滴，再用真空泵抽干亲和柱，收集全部洗脱液至试管中㊂在50ħ下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，加入1.0m L初始流动相，涡旋30s溶解残留物,0.22μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样㊂
5.3.2黄曲霉毒素固相净化柱和免疫亲和柱同时使用(对花椒㊁胡椒和辣椒等复杂基质)
5.3.2.1净化柱净化
移取适量上清液，按净化柱操作说明进行净化，收集全部净化液㊂
5.3.2.2免疫亲和柱净化
用刻度移液管准确吸取上述净化液4m L，加入46m L1%T r i t i o n X-100(或吐温-20)的P B S[使用甲醇-水溶液提取时，加入23m L1%T r i t i o n X-100(或吐温-20)的P B S]，混匀㊂按5.3.1.2和5.3.1.3处理㊂注：全自动(在线)或半自动(离线)的固相萃取仪器可优化操作参数后使用㊂
5.4液相谱参考条件
液相谱参考条件列出如下:
a)流动相:A相:5mm o l/L乙酸铵溶液;B相：乙腈-甲醇溶液(50+50);
b)梯度洗脱:32%B(0m i n~0.5m i n),45%B(3m i n~4m i n),100%B(4.2m i n~4.8m i n),
32%B(5.0m i n~7.0m i n);
c)谱柱:C18柱(柱长100mm，柱内径2.1mm；填料粒径1.7μm)，或相当者;
d)流速:0.3m L/m i n;
e)柱温:40ħ;
f)进样体积:10μL㊂
5.5质谱参考条件
质谱参考条件列出如下:
a)检测方式：多离子反应监测(MR M);
b)离子源控制条件：参见表1;
c)离子选择参数：参见表2;
d)子离子扫描图：参见图C.1~图C.8;
e)液相谱-质谱图：见图C.9㊂
表1离子源控制条件
电离方式E S I+
毛细管电压/k V3.5
锥孔电压/V30
射频透镜1电压/V14.9
射频透镜2电压/V15.1
表1(续)
离子源温度/ħ150锥孔反吹气流量/(L/h)50脱溶剂气温度/ħ500脱溶剂气流量/(L/h)800电子倍增电压/V650
表2离子选择参数表
化合物名称母离子
(m/z)
b1
定量离子
(m/z)
碰撞能量
e V
定性离子
(m/z)
碰撞能量
e V离子化方式
A F TB13132852224138E S I+
13C17-A F TB13302552330135E S I+
A F TB23152872525928E S I+
北京网通宽带
13C17-A F TB23323032527328E S I+
A F T G13292432528325E S I+
13C17-A F T G13462572529925E S I+
A F T G23312453028527E S I+
13C17-A F T G23482593030127E S I+
5.6定性测定游白水书付过
试样中目标化合物谱峰的保留时间与相应标准谱峰的保留时间相比较，变化范围应在ʃ2.5%之内㊂
每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表3规定的范围㊂
表3定性时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度/%>5020~5010~20ɤ10
允许相对偏差/%ʃ20ʃ25ʃ30ʃ50
5.7标准曲线的制作
在5.4㊁5.5的液相谱串联质谱仪分析条件下，将标准系列溶液由低到高浓度进样检测，以A F TB1㊁A F TB2㊁A F TG1和A F TG2谱峰与各对应内标谱峰的峰面积比值-浓度作图，得到标准曲线回归方程，其线性相关系数应大于0.99㊂
5.8试样溶液的测定
取5.3处理得到的待测溶液进样，内标法计算待测液中目标物质的质量浓度，按第6章计算样品中待测物的含量㊂待测样液中的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应适当减少取样量重新测定㊂
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