一、实验目的
了解ELISA的基本原理，及其优缺点； 掌握间接ELISA法的试验操作过程。
二、实验原理
酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是免疫酶技术的一种。本方法测定的基础是抗原抗体反应，微孔板包被有针对黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的特异性单克隆抗体，加入黄曲霉毒素标准品（或样品溶液）及黄曲霉毒素B1 酶标记物，标准品（或样品溶液）中的游离黄曲霉毒素B1 与黄曲霉毒素B1酶标记物竞争黄曲霉毒素B1 抗体，没有连接抗体的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将基质/发剂加入到孔中并且孵育，结合的酶标记物将基质/发剂转化为蓝的产物，加入反应停止液后使颜由蓝转变为黄，在450nm 处测量，吸收光强度与样品中黄曲霉毒素B1的浓度呈负相关。 三、实验器材
1、ELISA试剂盒
其组成如下：
1.1 包被抗体的反应板 48孔
禁娱是什么意思?1.2 A试剂：样品稀释液 l瓶
1.3 B试剂：AFB1标准溶液 l套(0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2 ng/mL)
1.4 C试剂：酶标抗原 l瓶
1.5 D试剂：酶标抗原稀释液 l瓶
1.6 E试剂：浓缩洗涤液 l瓶
1.7 F试剂：显底物液a l瓶
1.8 G试剂：显底物液b l瓶
1.9 H试剂：终止液 l瓶
1.10 反应板框架 l块
2、仪器
1.1报告与请示 酶标仪(内置450nm滤光片)
1.2 50µL微量移液器及配套吸头
1.3 恒温培养箱(0℃-50℃)
1.4 冰箱(dasein4℃-8℃)
1.5 感量0.0lg的天平
1.6 调速振荡器或超声波清洗器
1.7 离心机5000r/min
1.7 玻璃器皿：具塞锥形瓶，烧杯，分液漏斗，普通漏斗，量筒，具塞试管，滴管，移液管等
1.8 小型粉碎机或碾钵
1.9 其它：滤纸，吸水纸等
四、实验步骤
1、实验准备
1.1 样品处理：详见试剂盒说明书所列“样品处理方法”及“黄曲霉毒素国家允许量标准及样品稀释表”
1.1.1 脂肪含量小的固体样品(如大米、玉米、小米等)
称取5.0g样品(已粉碎)于100mL具塞三角瓶中，准确加入25.00mL甲醇水(1+1)溶液，于振荡器上剧烈震荡15min，过滤，弃去l/4初滤液，收集试样滤液，此液为样品提取液。根据样品的国家允许量标准，用A试剂(样品稀释液)将样品提取液进行适当稀释（如100µL样品提取液+100µL样品稀释液，总稀释10倍），即为待测样液。
1.1.2 花生
样品去皮粉碎(刀切或剪切)，称取5.0g于100mL具塞三角瓶中。加入25.0mL甲醇水(1+1)溶液和20mL正已烷(或石油醚)，于振荡器上剧烈震荡l0min，过滤于分液漏斗中，静置分层，放出下层甲醇水提取液，此液为样品提取液，根据样品的国家允许量标准，用A试剂(样品稀释液)将提取液进行适当稀释（如100µL样品提取液+300µL样品稀释液，总稀释20倍），即为待测样液。
1.1.3 一般饲料及原料
称取5.0g样品于100mL具塞三角瓶中，准确加入25.0mL甲醇水(1+1)溶液，于振荡器上剧烈震荡15min，过滤，弃去1/4初滤液后收集滤液，此液为样品提取液。根据样品的国家允许量标准，用A试剂(样品稀释液)将样品提取液进行适当稀释（如100µL样品提取液+900µL样品稀释液，总稀释50倍），即为待测样液。
1.2 试剂的配制
1.2.1每瓶C试剂（酶标抗原）中准确加入1.5mL D试剂(酶标抗原稀释液)，充分溶解，配成实验用酶标抗原溶液，2～8℃保存。
1.2.2 取适量E试剂(浓缩洗涤液)用超纯水稀释20倍待用。例如：取3mL E试剂(浓缩洗涤液)，加57mL超纯水，混匀后制成实验用洗涤液，足够24孔使用。
2、操作步骤
2.1 试剂平衡：将测试盒于室温中放置15min以上，平衡至室温。
2.2 小孔编号：根据实验需要截取相应孔数放置反应板框架上。设定l号孔为仪器调零孔，2-7唱游课号孔为AFB1标准对照孔，其余孔为样品孔。
2.3 洗涤：每孔加入250µL左右洗涤液，洗涤液不得溢出，放置1min后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板一次。
2.4 反应组成：按下列步骤所示（见表1），依次加入配制好的溶液及待测样液。
第一步：l号孔加入50µL A试剂(样品稀释液)，2-7号孔分别加入系列的B试剂(AFB1标准溶液：0，0.1，0.25，0.5，1，2ng/mL) 50µL，其余孔加入相应的待测样液。
第二步：l号孔加入50µL D试剂(酶标抗原稀释液)，其余各孔均加入50µL C试剂（酶标抗
原溶液）。
第三步：轻轻地振摇，使各孔中的反应物混合均匀。
表1 反应物组成
操作次序 | 加入量 | 孔 号 |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
1 | 50 µL | A | 0 | 0.1 | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | ……待测样液…… |
2 | 50 µL | D | C | C | C | C | C | C | C | C | C | C | C |
3 | 混 匀 |
| | | | | | b1 | | | | | | | |
2.5 反应：将反应板放入37℃恒温培养箱中孵育30min。
2.6 洗涤：取出反应板，用力甩掉反应液，拍干。每孔加入250µL左右洗涤液，洗涤液不得溢出，放置2min后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次。
2.7 显：每孔分别加入F试剂(显底物液a)和G试剂(显底物液b)各50µL，摇匀，将反应板放入37℃恒温培养箱中显15min。
2.8 终止与仪器测定：儒林外史的讽刺艺术每孔分别加入H试剂（终止液)50µL，摇匀后用酶标测定仪在450nm波长处测定各孔的吸光度A值。
3、试样测定与结果计算
将系列AFB1标准溶液(0，0.1，0.25，0.5，1，2ng/mL)测得的吸光度A值，绘制成标准曲线(见示意图)。横坐标为标准液浓度的常用对数值(1gC)，纵坐标为各标准液孔A值与0ng/mL标准液孔的A值的比值(A（标准液）／A（0ng/mL））（若同时有平行实验数据，则A及A0分别取其平均值，下同）。
黄曲霉毒素B 1标准曲线示意图(注：仅供参考)
计算待测样品孔A值与A(0ng/mL)的比值(A样品/A（0ng/mL）)，查标准曲线，可得到相应待测样液浓度(C)的常用对数值lgC，对其求反对数，可求得待测样液的AFB1浓度C。按下列公式计算出样品中AFB1的含量：
式中：
C：待测样液中AFB1含量(ng/mL)
V：样品提取液体积(mL)
m：样品质量(g)
D：样品稀释倍数
五、思考题
1、ELISA实验过程中，洗板的目的是什么？
2、如出现标准品无颜变化或者无序混乱，试分析其可能的原因。
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