#论著#维生素C对大鼠肾结石模型
张保陈一戎王志平王家吉周四维叶章章咏裳
=摘要>目的观察不同剂量维生素C(V it C)对大鼠肾结石模型体内活性氧(ROS)的影响及
Vit C、ROS与肾结石形成的关系。方法用乙二醇诱导Wistar大鼠产生肾草酸钙结石。30只大 鼠分为正常组，成石组，组(分三个不同剂量,V it C25、100、400mg#kg-1#d-1)，喂养15d。测定
血和右肾组织中丙二醛(M DA)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)含量；左肾冰冻切片，偏光显微镜观察结晶情况。结果成石组血和组织中的M DA分 别为(43.89?5.10)nmol/ml和(6.20?2.00)nmol/g pr，较正常组增高，差别有显著性意义(P<0.01
和P<0.001)，而抗氧化酶显著降低(P<0.01和P<0.001)。V it C400mg#kg-1#d-1组血
M DA(30.80?4.69)nmol/ml，较成石组降低(P<0.05)，与正常组比较差别无显著性意义(P>0.
05)，血SOD较成石组降低(P<0.05)，血CAT、GSH-Px较成石组升高(P<0.01);V it C400mg#
kg-1#d-1组肾组织中M DA(11.96?2.44)nmol/g pr，较成石组升高(P<0.05),SOD较成石组升
高(P<0.05),CAT、GSH-Px较成石组有所降低。肾组织晶体形成与V it C剂量呈正相关(r=0.
6685,P<0.01)。结论高草酸尿可使机体活性氧产生增多，脂质过氧化可能是肾损伤及草酸钙
结石形成的主要途径；活性氧变化及肾结石的形成与Vit C的剂量有关。
=关键词>肾结石；草酸钙；抗坏血酸；活性氧；大鼠
Eff ect of vitam in C on reactive oxygen species and their relation to formation of calcium oxalate
nephrolithiasis in Wistar rat models ZH A N G Bao*,CH EN Yirong,W A N G Zhip ing,et al.*Dep ar t-
ment of Urology,T ongj i H osp ital,T ongj i Medical Colle ge,H uaz hong University of Science and T echnolo-
gy,Wuhan430030,China
=Abstract>Objective T o determine the effect of vitamin C on r eactive ox ygen species(RO S)and
t heir relation to formation of nephrolithiasi s in W istar rat models.Methods Hypero xalur ia and CaO x
crystal were pro duced in Wistar rats by ethy lene glyco l in drinking w ater.T he animals were r andomly divid-
ed into3g roups,ie,control group,nephrolithiasis gr oup and v itamin C treatment g roups at a dose of25,100
and400mg#kg-1#d-1.A fter15days,malondialdehy de(M DA),catalase(CAT),superox ide dismutase
(SOD)and glutathio ne perox idase(GSH-Px)in blood and kidney tissue were measured.T he presence of
CaOx crystal w er e scored on a basis of-~++++.Results M DA increased and antiox idase de-
creased sig nificantly in kidney tissue and bloo d of the nephrolithiasi s g roup.Co mpared w ith the nephro lithia-
si s group,M DA(30.80?4.69)nmol/L and SOD decreased significantly(P<0.05)in blood,but M DA
(11.96?2.44)nmol/g pr and SOD increased significantly in kidney tissue of the vitamin C tr eatment
g roups(P<0.05).T he for ming of CaOx crystal had a positive corr elation with the dose of vitamin C(r=
0.6685,P<0.01).C onclusions Hyperox aluria can produce more ROS in mammals.T he lipid peroxida-
tion may be the cause of the formation of calcium oxalate nephrolithiasis.T he alteration of ROS and the
formation of nephrolithiasis hav e r elation with the dose of vitamin C.
=Key words>K idney calculi;Calcium oxalate;V itmin C;Reactive ox ygen species;Rats
作者单位:430030武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科(张保、周四维、叶章、章咏裳)；兰
州医学院第二附属医院泌尿外科研究所(陈一戎、王志平、王家吉)
高草酸尿是草酸钙结石的主要危险因素之一。草酸主要在肝脏自甘氨酸经乙醛酸途径形成[1]，其中至少有甘氨酸氧化酶、乳酸脱氢酶及黄嘌呤氧化酶三种氧化酶起作用，伴活性氧的产生。活性氧与多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，能造成脂肪酸链断裂，使细胞膜受损，而肾小管上皮细胞损伤是肾结石形成的中心环节[1]。维生素C(Vit C)可作为电子供体直接清除活性氧，但大剂量Vit C喂养动物却可导致肾结石形成[2]。我们观察大鼠肾结石模型体内活性氧的变化及Vit C对其影响，报告如下。
材料与方法
雄性Wistar大鼠30只。体重220~280g。适应环境3d后，随机分为正常组、成石组和Vit C组。均以标准颗粒饲料喂养；正常组饮用自来水，成石组及Vit C组饮用含1%乙二醇及0.5%氯化铵的自来水；正常组及成石组每日以2m l/kg 生理盐水腹腔注射;Vit C组分为三个不同剂量组，每日分别以Vit C25mg/kg、100mg/kg、400 mg/kg腹腔注射。各组先以自来水标准颗粒饲料喂养，按分组3d，然后按各分组相应喂养及15d。2.5%硫喷妥钠1ml/kg腹腔注射麻醉，取血2.5ml入冰浴内的肝素钠抗凝试管，左肾作冰冻切片，右肾制成组织匀浆。
硫代酸(TBA)法测定丙二醛(MDA)；黄嘌呤氧化酶-氮蓝四唑还原法测定超氧化物歧化酶(SOD)；紫外分光光度法测定过氧化氢酶(CAT);5, 5c-二硫代双(2-硝基苯甲酸)[DT NB]比法测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，具体方法参见文献[3]。
偏光显微镜观察，记录肾组织结晶情况:(-)为无任何结晶亮点;(?)为散在细小结晶亮点;(+)为细小结晶亮点广泛但不成堆;(++)为结晶变粗大、成堆、但散在不连接;(+++)为成堆结晶局部互相连接;(++++)为广泛成堆结晶，连接成片。
统计学方法：成石组与正常组之间的统计学分析用t检验;Vit C组、成石组、正常组之间统计学分析用不配对的多组之间F检验；肾脏结晶沉积比较用秩和检验；肾脏结晶情况与Vit C剂量关系用等级相关性分析。
结果
一、大鼠肾结石模型体内活性氧信号变化
成石组血和组织中M DA较正常组显著升高，而抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)均显著降低(表1)。肾冰冻切片偏光显微镜观察，正常组未见结晶亮点，均为(-)；成石组1/6(+++)、5/6(++)。
二、Vit C对大鼠肾结石模型体内M DA、抗氧化酶及肾组织结晶的影响(表1)
表1显示,Vit C各组血和组织中抗氧化酶及脂质过氧化产物表现不一致。组血M DA显著低于成石组，而组织中MDA均显著高于成石组与正常组。组血SOD显著低于正常组，但随Vit C剂量增加有升高趋势；正常组和组组织SOD均显著高于成石组，但随Vit C剂量增加有降低趋势。血GSH-P
x随Vit C剂量增加逐渐升高；组织GSH-Px随Vit C剂量增加有降低趋势。血CAT亦随Vit C剂量增加逐渐升高；组织CAT随Vit C剂量增加而降低。肾组织结晶沉积,25mg/ kg组3/6(++)、3/6(+)，较成石组减少;100mg/ kg组2/6(+++)、4/6(++),400m g/kg组4/6 (+++)、2/6(++)，均较成石组增多，但差别均无显著性意义。肾组织结晶与Vit C剂量呈正相关(r =0.6685,
表1Vit C对大鼠肾结石模型体内M DA和抗氧化酶的影响(
x?s)
项目例数正常组成石组
Vit C组
25mg/kg组100m g/kg组400mg/kg组血M DA(nmol/ml)622.07?4.98by43.89?5.1030.01?8.23bz27.22?7.53bz30.80?4.69bz
组织M DA(nmol/g pr)6 4.14?1.45cy 6.20?2.00az9.32?1.57dzby10.55?2.94ayby11.96?2.44ayby
血SOD(Nu/ml)6378.89?12.15by269.34?13.98302.42?19.37ay325.31?17.22ay341.87?13.25a z bz 组织SOD(Nu/g pr)6241.92?10.85203.94?11.74ay248.71?10.49bz246.72?15.22by237.69?10.75bz
血GSH-Px(U/mg Hb)630.98?0.7022.85?0.57az25.30?0.28az31.23?0.50bzcz33.93?0.45bycy托尔斯泰的故事
组织GSH-Px(U/mg pr)670.03?4.9661.43?4.64ay63.11?3.4959.80?3.73az59.37?4.03ay
血CAT(U/g H b)682.01?3.91by73.86?3.52c z77.68?4.6675.68?4.0091.58?4.20ayby cydy 组织CAT(U/g pr)6287.93?8.76by cy241.02?9.87c ydy197.17?15.52dz172.46?28.14ay162.71?12.91a yby cy 注:a：与正常组比较;b：与成石组比较;c：与Vit C25mg/kg组比较;d：与Vit C100mg/kg组比较。z:P<0.001, y:P<0.01,z:P<0.05;pr：蛋白质;Hb：血红蛋白
P<0.01)。总的趋势是,Vit C各组血中脂质过氧化产物较正常组升高但较成石组降低，抗氧化酶较正常组降低但较成石组升高；组织中脂质过氧化产物较正常组和成石组均升高，抗氧化酶低于正常组，有的甚至低于成石组。
讨论
肾结石的形成起始于肾小管上皮细胞损伤，沈绍基等报告[4]给大鼠喂乙二醇，发现肾脏的病理改变，特别是肾小管病理改变先于尿结晶的出现，提示草酸单独即可诱导细胞损伤，但机理尚不完全清楚。体内生成草酸需经一系列氧化过程，伴有活性氧的产生。Grases等[5]在体外模拟肾脏条件，证明自由基可引起肾上皮细胞损伤，产生一个有利于晶体生长的环境，而抗氧化剂Vit C、甘露醇可抑制草酸钙
晶体的形成。大量实验证明，活性氧参与了机体许多疾病的病理生理过程，如动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤、炎性反应、肿瘤和衰老等。
临汾十中
本实验中，乙二醇诱导的大鼠肾结石模型血及组织中丙二醛浓度升高，抗氧化酶活性降低，与文献报道一致。抗氧化酶活性降低提示机体动用了大量抗氧化酶，丙二醛浓度升高提示机体有组织过氧化损伤，这些都间接支持在草酸诱导的成石动物体内有大量活性氧产生，草酸对细胞代谢的影响在于脂质过氧化。脂质过氧化为氧分子和多不饱和脂肪酸的相互作用。机体组织的抗氧化损伤依赖于自由基与抗氧化系统的平衡。草酸可诱导脂质过氧化，从而破坏细胞膜的完整结构。在细胞培养中，草酸单独即可对肾上皮细胞产生毒性作用，草酸钙结晶仅是加强了这一作用[6]。T hamilselvan等[7]实验证明，草酸的这一毒性由脂质过氧化引起。Scheid 等[8]发现草酸可引起自由基显著升高和LLC-PK1单层细胞死亡。以上研究结果均证明活性氧参与了肾小管的损伤过程，过氧化损伤可能是肾结石形成的重要机制。
V it C可作为电子供体直接清除活性氧，并可使V itE还原，从而起到抗氧化作用。体外实验发现V it C可防止肾上皮细胞受到自由基的损伤而预防草酸钙结晶形成[5]。草酸诱导的动物模型中亦伴有Vit C降低[9]。但过量的Vit C可诱导动物产生高草酸尿和肾结石形成[2]。本实验25mg/kg组肾组织结晶沉积情况较成石组减少，但400m g/kg组肾组织结晶沉积情况则较成石组增多。可能小剂量Vit C可补充成石饮食导致的Vit C降低，起抗氧化作用，而大剂量Vit C在体内可经二酮古洛糖酸途径转变为草酸[10]。V
it C经非酶途径产生的草酸占内源性草酸的20%~40%[1]。本实验Vit C各组，抗氧化酶和脂质过氧化产物在血及组织中表现不一致，可能与Vit C既是抗氧化剂又是草酸生成剂的双重作用有关。组织中抗氧化酶随Vit C剂量增加较成石组逐渐降低,MDA随Vit C剂量增加较成石组逐渐升高，此变化与肾组织内结晶沉积逐渐增多相对应，肾组织结晶沉积情况与Vit C剂量呈正相关。这些结果说明，大剂量Vit C可使机体草酸产生增多，致大量活性氧生成，引起肾组织的过氧化损伤，有利于肾结晶的沉积，再一次证明了活性氧在肾结石形成中的重要作用。因草酸可独立引起肾细胞过氧化损伤，本实验结果提示肾结石形成过程中的过氧化损伤是高草酸尿直接在肾脏局部诱导产生的，此结论有待进一步证实。植物编艺
参考文献
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(收稿日期:2001-12-26)
(本文编辑：贾云丽)
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