水杨酸处理诱导采后甜瓜抗坏血酸-还原型谷胱甘肽循环代谢清除过氧化氢的...

水杨酸处理诱导采后甜瓜抗坏血酸-还原型谷胱甘肽循环代谢清除过氧化氢的作用及机制

杨乾，范存斐，王毅，任亚琳，毕阳*

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州 730070）

摘要：目的：研究抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）-还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）循环代谢在水杨酸处理采后甜瓜诱导的过量H2O2清除过程中的作用。方法：用4 mmol/L水杨酸浸泡‘玉金香’厚皮甜瓜10 min，测定处理后果实常温贮藏过程中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，分析活性氧的积累水平、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）活力，以及AsA-GSH循环过程相关酶活力及产物和底物含量。结果：水杨酸处理降低了果实MDA含量，第10天处理组MDA含量较对照组降低14.6%；显著提高了果实O2－·的产生速率和H2O2含量（P＜0.05），其中处理后第2天O2－·的产生速率高出同期对照组的1.9 倍，第6天H2O2含量高出对照组果实29.7%；提高了果实SOD活力，但抑制了CAT活力，说明H2O2的清除可能是依赖于除酶促系统外的其他系统。此外，水杨酸处理提高了果实抗坏血酸过氧化物酶、单脱氢抗坏血酸过氧化物酶、脱氢抗坏血酸还原酶和谷胱甘肽还原酶的活力，增加了AsA和氧化型谷胱甘肽的含量，降低了脱氢抗坏血酸和GSH的含量。结论：水杨酸处理诱导了厚皮甜瓜果实的氧爆，抑制了MDA产生，由水杨酸诱导产生的过量H2O2主要依靠AsA-GSH循环系统清除。

关键词：甜瓜；水杨酸；活性氧；抗坏血酸-还原型谷胱甘肽循环

Role and Underlying Mechanism of the Ascorbic Acid-Reduced Glutathione Cycle in Scavenging Hydrogen Peroxide in Postharvest Melons Induced by Salicylic Acid

YANG Qian, FAN Cunfei, WANG Yi, REN Yalin, BI Yang*

(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

Abstract: Objective:To ascertain the role of the ascorbic acid-reduced glutathione (AsA-GSH) cycle in scavenging excessive H2O2 in melons induced by salicylic acid (SA) during postharvest storage. Methods: Melon (cv. Yujinxiang) fruit were soaked in 4 mmol/L SA for 10 min, and stored at ambient temperature. Malondialdehyde (MDA) content and the accumulation level of reactive oxygen species, and the activity of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) were determined as well as enzyme activities involved in the AsA-GSH cycle and the contents of substrate and product. Results:SA treatment reduced MDA content, resulting in a 14.6% reduction in MDA content compared with the control group on day 10.

SA significantly increased superoxide anion radical production rate and H2O2 content in the fruit (P < 0.05). On day 2 after the treatment, the production rate of superoxide anion radical in the treated group was 1.9 times higher in than that in the control at the same time point, and H2O2 content was 29.7% higher than that in the control on day 6. The chemical increased SOD activity and inhibited CAT activity, suggesting that scavenging of H2O2 is not dependent on the enzymatic system but other systems. Moreover, SA increased the activity of ascorbate peroxidase, glutathione reductase, monodehydroascorbate peroxidase, and dehydroascorbate reductase as well as the contents of ascorbic acid and oxidized glutathione, and decreased the contents of dehydroascorbic acid and reduced glutathione. Conclusion:SA treatment promoted oxygen burst in melons and reduced MDA content. Excessive H2O2 induced by SA was scavenged mainly through the AsA-GSH cycle.

Keywords: melon; salicylic acid; reactive oxygen species; ascorbic acid-reduced glutathione cycle

DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191128-276

收稿日期：2019-11-28

基金项目：公益性行业（农业）科研专项（201303075）

康尼可一氧化氮第一作者简介：杨乾（1993—）（ORCID: 0000-0001-9740-7445），男，硕士研究生，研究方向为果蔬采后生物学与技术。

E-mail: *********************

*通信作者简介：毕阳（1962—）（ORCID: 0000-0002-0269-4814），男，教授，博士，研究方向为果蔬采后生物学与技术。

E-mail: ***************

中图分类号：TS251.5＋2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2021）01-0243-07引文格式：

杨乾, 范存斐, 王毅, 等. 水杨酸处理诱导采后甜瓜抗坏血酸-还原型谷胱甘肽循环代谢清除过氧化氢的作用及机制[J]. 食品科学, 2021, 42(1): 243-249. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191128-276. www.spkx

YANG Qian, FAN Cunfei, WANG Yi, et al. Role and underlying mechanism of the ascorbic acid-reduced glutathione cycle in scavenging hydrogen peroxide in postharvest melons induced by salicylic acid[J]. Food Science, 2021, 42(1): 243-249. (in Chinese with English abst

ract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191128-276. www.spkx

化学诱抗剂可有效诱导厚皮甜瓜对多种采后真菌的抗性[1]，其诱导抗性的机制与激活苯丙烷、活性氧和能量等代谢密切相关[2]。氧爆是诱抗剂处理果实后的典型反应[3]，氧爆初期产生的少量活性氧可作为信号分子激活相关防御反应，而后期产生的大量活性氧则具有直接抑菌、促进氧化交联等作用[4]。然而，过量活性氧会破坏细胞膜结构、降低果实的抗病性[5]。植物体内已进化出有效的清除系统来平衡活性氧，以防止过量活性氧的伤害[6]。清除系统包括酶促和非酶促两类，前者包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶、过氧化氢酶（catalase，CAT）以及抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）-还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）循环相关酶，后者包括VE、VC、谷胱甘肽、多酚和类黄酮等[7]。有研究表明，采后水杨酸处理柑桔[8-9]、苯并噻二唑（benzothiadiazole，BTH）处理苹果[10]能诱导果实氧爆，同时提高其SOD 活性，但会降低CAT活性。由此表明，诱抗剂所诱导的清除H2O2不依赖于过氧化氢酶。AsA-GSH循环是植物体内存在的一个重要抗氧化保护系统，主要通过GSH 和AsA的氧化还原来清除H2O2，在维持H2O2产生和清除平衡中发挥了重要作用[11]。有研究表明，水杨酸及其类似物BTH处理能促进柑橘和苹果AsA-GSH循环[9-10]。由此表明，AsA-GSH循环在诱抗剂激发的H2O2清除中具有重要作用。本课题组前期研究发现，采后BTH处理会通过激发厚皮甜瓜的氧爆来提高果实的抗病性[12]，但AsA-GSH循环如何系统参与诱抗剂激发的厚皮甜瓜H2O2清除鲜见报道。本研究以‘玉金香’厚皮甜瓜为试材，研究采后水杨酸（salicy

lic acid，SA）浸泡处理对果实活性氧的积累和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的影响，测定处理后果实的SOD和CAT活力，以及AsA-GSH循环代谢酶活性和产物含量。以期为揭示AsA-GSH循环在清除诱抗剂激发的果实过量H2O2方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试‘玉金香’甜瓜于2010年7月采自甘肃省民勤县收成乡露地大田。选取大小一致、成熟度大约九成、单果质量约0.5～0.7 kg、可溶性固形物质量分数约12%～13%、无损伤、无病虫害的果实，单果套发泡网袋，入包装箱（20 个/箱），第2天运抵甘肃农业大学采后生物学与技术实验室，于常温（（22±2）℃、相对湿度55%～60%）下贮藏待用。

SA（分析纯）天津市光复精细化工研究所。 1.2 仪器与设备

3K30台式高速冷冻离心机德国Sigma公司；UV-2450紫外-可见光分光光度计日本岛津公司；DDS-307A电导率仪上海精密科学仪器有限公司；DW-HL218超低温冰箱中科美菱低温科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甜瓜处理

甜瓜处理参照范存斐等[13]的方法。SA用少量体积分数75%乙醇溶液溶解后加蒸馏水配制成浓度为4 mmol/L的溶液（内含体积分数0.05% Tween-80，用1 g/100 mL NaOH溶液调节pH值至7.0）。取甜瓜果实表面用自来水冲洗干净后晾干，将晾干后的果实浸入4 mmol/L的SA溶液中10 min，取出晾干后，单果套发泡网袋，放入包装箱（20个/箱），于常温（（22±2）℃、相对湿度55%～60%）下贮藏待用。以清水（内含体积分数0.05% Tween-80，用1 g/100 mL NaOH溶液调节pH值至7.0）处理作对照。每处理用果实40 个，重复3 次。

参照Ren Yalin等[14]的方法取样，分别于处理后0、2、4、6、8、10 d用直径5 mm打孔器打取皮下3～10 mm 处组织3 g，锡箔纸包好后液氮冷冻，在－80 ℃超低温冰箱中保存待测。

1.3.2 MDA含量的测定

参照Hodges等[15]的方法测定MDA含量。取3 g冷冻组织，加5 mL 100 g/L三溶液研磨，研磨后的匀浆于4 ℃、12 000×g条件下离心20 min，取上清液，加入相应试剂后，分别测定其在450、532 nm及600 nm波长处的吸光度，MDA含量单位为µmol/g。

1.3.3 O2－·产生速率和H2O2含量的测定

O2－·产生速率的测定参考Ren Yalin等[14]的方法。取

3 g冷冻组织，加5 mL 0.1 mol/L pH 7.8磷酸盐缓冲液（含0.1 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，P V P）），在冰浴条件下进行研磨，匀浆于4℃、12 000×g条件下离心20 min，取上清液，加入相应试剂后测定其在530 nm波长处的吸光度。O2－·产生速率单位为nmol/（min·g）。

抗坏血酸氧化酶H2O2含量的测定参照Prochazkova等[16]的方法。取3 g 冷冻组织，加入3 mL经4 ℃预冷的丙酮，冰浴条件下研磨成匀浆后，于4 ℃、12 000×g条件下离心20 min。取上清液，加入相应试剂后测定其在410 nm波长处的吸光度。H2O2含量单位为mmol/g。

1.3.4 SOD和CAT活力测定

粗酶液的提取参照Lacan等[17]的方法并略作修改。取3 g冷冻组织，分别向研钵内加入3 mL 0.1 mol/L p H7.5磷酸盐缓冲液（含5m m o/L二硫苏糖醇和2 g/100 mL PVP），在冰浴条件下研磨成匀浆后于4 ℃、12 000×g离心30 min，上清液即为粗酶液。

SOD活力测定参照Oberley等[18]的方法并略作修改，测定反应液在560 nm波长处吸光度。以每克组织抑制氮蓝四唑光化还原的50%定义为一个酶活力单位（U），SOD活力单位为U/g。

CAT活力测定参照Clairbone[19]的方法并略作修改，测定反应液在240 nm波长处的吸光度。以每克组织在反应体系中每分钟催化1 nmol H2O2降解定义为一个酶活力单位（U），CAT活力单位为U/g。

1.3.5 AsA-GSH循环代谢酶活力的测定

粗酶液的提取参照Nakano等[20]的方法。取3.0 g冷冻组织于预冷的研钵中，加5 mL预冷的50 mmol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液（含1 mmol/L抗坏血酸、1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、2 g/100 mL PVP，0.25% TritonX-100）研磨，于4 ℃、16 000×g离心20 min，上清液即为粗酶液。

抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力的测定参照Nakano等[20]的方法。取上清液加入相应试剂后，测定其在290 nm波长处的吸光度。以每克组织每分钟氧化1 µmol AsA定义为一个酶活力单位（U），APX活力单位为U/g。

谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）活力的测定参照Halliwell等[21]的方法。取上清液，加入相应试剂后测定其在340 nm波长处的吸光度。以每克组织每分钟氧化1 µmol烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）定义为一个酶活力单位（U），GR活力单位为U/g。

脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）活力的测定参照Nakano等[20]的方法并略作修改，取上清液，加入相应试剂后测定其在265 nm波长处的吸光度。以每克组织每分钟还原1 µmol AsA定义为一个酶活力单位（U），DHAR活力单位为U/g。

单脱氢抗坏血酸还原酶（monodehydroascorbate reductase，MDHAR）的活力测定参照Nakano等[20]的方法并修改，取上清液，加入相应试剂后测定其在340 nm波长处的吸光度。以每克组织每分钟还原1 µmol NADPH定义为一个酶活力单位（U），MDHAR活力单位为U/g。

1.3.6 AsA-GSH循环产物和底物含量的测定

AsA、脱氢抗坏血酸（dehydroascorbate，DHA）含量测定参照Turcsányi等[22]的方法并略作修改。取3 g 冷冻组织，加入5 mL 100 mmol/L盐酸，冰浴条件下充分研磨，于4 ℃、7 800×g离心10 min，取上清液立即用于后续实验。AsA含量的测定：取100 μL上清液加入2 mL 100 mmol/L磷酸钾缓冲液，再加入0.5 mL蒸馏水，在265 nm波长处测其吸光度，AsA含量单位为μg/g。

总抗坏血酸含量的测定：取100μL上清液加入2 mL 100 mmol/L磷酸钾缓冲液和0.5 mL 2 mmol/L二硫苏糖醇溶液，置于室温下反应8 min后，在265 nm波长处测定其吸光度，总抗坏血酸含量单位为μg/g。总抗坏血酸含量减去AsA含量即为DHA含量，DHA含量单位为μg/g。

GSH和氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）含量的测定参照Brehe等[23]的方法并略作修改。取3 g冷冻组织，加入5 mL预冷的体积分数6%偏磷酸（pH 2.8），冰浴条件下研磨成匀浆，于4 ℃、12 500×g 条件下离心20 min，所得上清液为粗酶液。

总谷胱甘肽含量测定：500 μL上清液加入2.5 mL 反应液，其中反应液包含800 μL反应液1（110 mmol/L Na2HPO4·7H2O、40 mmol/L NaH2PO4·H2O、15 mmol/L EDTA、0.3 mmol/L二硫代二硝基苯甲酸、0.04 g/100 mL 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、800μL反应液2（1m m o l/L E D TA、50m m o l/L 咪唑和0.02g/100m L B S A）、800μL反应液3（5 g/100 mL pH 7.5 Na2HPO4）和100 μL 9 mmol/L NADPH，以体积分数6%偏磷酸（pH 2.8）代替粗酶液作为对照，测定反应体系在412 nm波长处的吸光度，总谷胱甘肽含量单位为μg/g。

GSSG及GSH含量测定：在500 μL粗酶液中共加入2.5 mL乙烯吡啶，25 ℃下水浴1 h，在412 nm波长处测定其吸光度，GSSG含量单位为μg/g。GSH的含量由总谷胱甘肽含量减去GSSG含量得到，单位为μg/g。

1.4 数据统计与分析

上述每项指标测定至少重复3 次。用Excel 2010软件计算平均值和标准差，用SPSS 19.0软件进行Duncan’s多重差异显著性分析（P＜0.05）。

结果与分析

2.1 SA 处理对甜瓜果实贮藏过程中MDA 含量的影响

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*.同一贮藏时间两组差异显著（P ＜0.05）。下同。图 1 SA处理对甜瓜果实贮藏过程中MDA含量的影响

Fig. 1 Effect of SA treatment on MDA content in melons

由图1可知，SA 处理组和对照组果实的MDA 含量在贮藏期间逐渐升高，SA 处理组果实的MDA 含量在贮藏的中后期低于对照组，第10天时低于对照组14.6% （P ＜0.05）。说明SA 处理可以抑制甜瓜贮藏期间MDA 的产生，有利于维持细胞膜的完整性。2.2 SA 处理对甜瓜果实贮藏过程O 2－·产生速率和H 2O 2含量的影响

贮藏期间，SA 处理组和对照组果实的O 2－·产生速率均呈先升高后降低再升高的趋势，SA 处理组果实的O 2－·产生速率均显著高于对照组，第2天较同期对照组照组高1.9 倍（P ＜0.05）（图2A ）。SA 处理组和对照组果实的H 2O 2含量在贮藏期间呈现先上升后下降的趋势，SA 处理组果实的H 2O 2含量整体上显著高于对照组，处理后第6天较对照组高29.7%（P ＜0.05）（图2B ）。O 2－·产生速率和H 2O 2含量结果表明，SA 处理促进了厚皮甜瓜果实的氧爆。

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图 2 SA处理对厚皮甜瓜果实贮藏过程中O 2－·产生速率（A）

和H 2O 2含量（B）的影响

PORNO GRAFFITTI

Fig. 2

Effect of SA treatment on superoxide anion radial production rate (A) and H 2O 2 content (B) in melons

2.3 SA 处理对甜瓜果实贮藏过程SOD 及CAT 活力的影响

贮藏期间，SA 处理组和对照组果实的SOD 活力均呈先下降后上升再下降的趋势，SA 处理组果实的SOD 活力整体高于对照组，第6天较对照组高21.3%（P ＜0.05）（图3A ）。SA 处理组和对照组果实的CAT 活力在贮藏期间总体呈下降趋势，且SA 处理组果实的CAT 活力明显低于对照组，第4天较对照组低22.9%（P ＜0.05）

（图

3B ）。SOD 和CAT 活力的结果表明，SA 处理提高了厚皮甜瓜果实的SOD 活力，但抑制了CAT 活力。

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图 3 SA处理对厚皮甜瓜果实贮藏过程中SOD（A）和CAT（B）

活力的影响

Fig. 3

Effect of SA treatment on SOD (A) and CAT (B) activities in melons

2.4 SA 处理对甜瓜果实贮藏过程AsA-GSH 循环代谢相关

物质含量和酶活力的影响

贮藏期间，SA 处理组果实的APX 活力整体呈先上升后下降的趋势，对照组果实的活力基本保持平稳，后期缓慢降低再升高。SA 处理组果实的APX 活力明显高于对照组，第2天较对照组高2.6 倍（P ＜0.05）（图4A ）。 SA 处理组和对照组果实的MDHAR 活力在贮藏期间呈先下降后上升的趋势，SA

处理组果实的活力明显高于对照组，处理后第10天较对照组高70.8%（P ＜0.05）（图4B ）。SA 处理组和对照组果实DHAR 活力在贮藏期间呈现先上升后下降的趋势，处理组果实的活力明显高于对照组，第6天时较对照组高67.8%（P ＜0.05）（图4C ）。SA 处理组果实的GR 活力在贮藏期间呈现先

上升后下降的趋势，对照组果实的GR活力则缓慢上升并趋于平稳，SA 处理组果实GR 活力明显高于对照组，处理后第4天较对照组高1.3 倍（P ＜0.05）（图4D ）。

贮藏期间，SA 处理组和对照组果实中AsA 含量呈先下降后上升的趋势，但SA 处理组果实的AsA 含量明显

高于对照组，第8天较对照组高1.4 倍（P ＜0.05）（图4E ）。SA 处理组和对照组果实DHA 含量在贮藏期间先上升后下降并趋于平稳，SA 处理组果实的DHA 含量明显低于对照组，处理后第4天低于对照组64.2% （P ＜0.05）（图4F ）。对照组和SA 处理组果实中GSSG 含量在贮藏期间呈先下降后缓慢上升的趋势，但SA 处理组果实的GSSG 含量明显高于对照组，第8天高出对照组71.5%（P ＜0.05）（图4G ）。SA 处理组果实的GSH 含量在贮藏期间呈先上升后降低再升高的趋势，对照组果实的GSH 含量呈先上升后平稳降低的趋势，但SA 处理组果实的GSH 含量明显低于对照组，处理后第8天低于同期对照组66.1%（P ＜0.05）（图4H ）。AsA-GSH 循环中的4 种抗氧化酶（APX 、MDHAR 、DHAR 和GR ）与AsA 、DHA 、GSH 和GSSG 相互作用可以清除H 2O 2。上述结果表

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明，SA 处理激活了厚皮甜瓜果实的AsA-GSH 循环，促进了H 2O 2的清除。

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一起又看流星雨最后一集G S H 䟿/˄µg /g ˅䍞㯿䰤/d

A. APX活力；

B. MDHAR活力；

C. DHAR活力；

D. GR活力；

E. AsA含量；

F. DHA含量；

G. GSSG含量；

H. GSH含量。图 4 SA处理对厚皮甜瓜果实贮藏过程中AsA-GSH循环代谢