应用与环境生物学报 1999,5(Suppl):170～174 Chin.J.Appl.Environ.Biol. 1999210205
嗜热厌氧细菌Clostridium sp.EVA4菌株 韩如 陈美慈 闵 航 赵宇华 马晓航
(浙江大学华家池校区生物科学系 杭州 310029)
摘 要 用分离获得的嗜热厌氧纤维素降解细菌Clostridium sp.E VA4菌株进行了直接转化纤维素产生乙醇的 动力学、发酵最适条件及其影响因子的研究.结果表明,E VA4菌株在pH6.2～8.9,θ45℃～60℃的范围内能直接
转化纤维素滤纸产生乙醇，最适pH为7.5～8.0，最适θ为55～60℃.E VA4菌株能利用纤维素滤纸，纤维素粉
Whatman CF II，微晶纤维素，纤维素粉M N300和未经处理的玉米秆芯，甘蔗渣，水稻秸秆产生乙醇.乙醇浓度，纤
维素降解率和培养基还原糖浓度均随培养时间延长而增大.不同的纤维素材料、pH、θ、底物浓度、酵母粉含量、振荡、培养气相、外加O2和乙醇等条件均能影响E VA4菌株转化纤维素为乙醇的能力.最适条件下E VA4菌株利 用1%纤维素滤纸培养120h产乙醇浓度为1123mg/L，纤维素降解率为59%.
关键词 梭状芽孢杆菌；纤维素；高温厌氧转化；乙醇
中图法分类号 T Q223.121¬Q939.124
STU DIES ON DIRECT CONVERSION OF CE LL U LLOSE
TO ETHANOL BY A THERMOPHI LIC ANAEROBIC
BACTERIUM,CLOSTRIDIUM SP.STRAIN EVA4
H AN Ruyang,CHE N Meici,MI N Hang,ZH AO Y uhua&MA X iaohang
(Department o f Biological Science,Huajiachi Campus,Zhejiang Univer sity,Hangzhou 310029)
Abstract The direct conversion of cellulose to ethanol by Clostridium sp.strain E VA4,a therm ophilic,
anaerobic and cellulolytic bacterium is olated in our laboratory was studied,including the characteristics of kinet2
ics,optimum conditions of fermentation and affecting factors.The results indicated that E VA4strain could di2
rectly converse cellulose filter paper to ethanol in the range of pH6.2～8.9and tem perature45℃～60℃with
the optimum pH and tem perature of7.5～8.0and55℃～60℃,respectively.S train E VA4could produce
ethanol from cellulose filter paper,cellulose powder Whatman CFII,microcrystalline cellulose,cellulose powder
M N300and unpretreated maize stem core,rice straw and sugarcane residue.The concentrations of ethanol,re2
ducing sugars and the rate of cellulose2degradation increased during the growth of E VA4strain.The conversion
of cellulose to ethanol by the strain might vary with different cellulose materials,pH,tem perature,concentra2
tion of substrate and yeast extract,stirring,gas phase in headspace,exgenous O2and ethanol.Under optimum
condition,strain E VA4could produce1123mg/L ethanol from1%cellulose filter paper in120h with59%of
cellulose degradation rate.
K eyw ords Clostridia;cellulose;therm opilic anaerobic conversion;ethanol
以热纤梭菌Clostridium thermocellum为代表的嗜热厌氧细菌在高温厌氧条件下直接转化纤维素为乙醇的特性已为人们所熟知[1].关于该类细菌转化纤维素产乙醇特性的研究对人们进一步了解纤维素微生物降解
收稿日期:1999205219 接受日期:1999206230
3浙江省自然科学基金项目
机理、自然界物质转化和纤维素资源的最优化利用具有重大的理论意义和潜在的应用价值，因而引起国内外的重视[5～7].作者从新鲜牛粪和高温堆肥中分离和纯化得到4株嗜热厌氧梭状芽孢杆菌(Clostridium sp.)，分别命名为E VA1,E VA2,E VA3和E VA4，均具有在高温厌氧条件下直接转化纤维素产生乙醇的能力.本文详细报道了菌株E VA4直接转化纤维素产生乙醇的动力学和环境因子对该菌株直接转化纤维素产生乙醇的影响.1 材料和方法
deadpixeltest1.1 菌种
供试菌株E VA4从本室保存多年的纤维素降解富集物中利用纤维素粘附厌氧滚管的方法分离纯化得到.以E VA4菌株在57℃培养48～60h 纤维素滤纸溃烂时的培养物作为本实验接种物，接种量2%.
1.2 培养基
用于实验的基础培养基是经修改的C M3培养基，每1000m L 成分如下:K H 2PO41.5g ;K 2HPO 4・
3H 2O 2.90g ;(NH 4)2S O 41.30g ;MgCl 2・6H 2O 1.00g ;CaCl 20.15g ；酵母粉2g ；还原剂L 2半胱氨酸0.5g ；氧化还原电位指示剂0.1%刃天青2.00m L (其中用于还原糖浓度测定的培养基不加刃天青等氧化还原电位指示剂)；碳源为纤维素滤纸(剪成1cm ×4cm 条状)或微晶纤维素粉.使用Hungate 厌氧操作技术配制培养基，用4m ol/L NaOH 调节初始pH 至7.5～8.0，培养基分装于60m L 或100m L 厌氧瓶中，每瓶30m L ，气相为100%的N 2.
1.3 天然植物纤维素材料的处理
为检测E VA4菌株的纤维素利用能力，用于实验的各种植物纤维素材料处理如下：各种纤维素粉不作处理；纤维素滤纸、玉米叶剪成1cm ×4cm 的条状；水稻秸秆(剪成3cm 长)和玉米叶用清水洗净后57℃烘干；玉米秸秆除去表皮，剪碎(大小以能放入厌氧瓶为宜)；甘蔗渣用沸水煮1h 以除去可溶性糖分,57℃烘干.
1.4 测定方法
1.4.1 乙醇浓度测定 取1m L 培养液经10000r/min 离心后用气相谱法测定.使用SP 2501N 型气相谱仪，采用氢火焰离子检测器,2m 长的不锈钢柱2根，担体为P orapak Q ，柱温130℃，汽化室温210℃，检测室温250℃，载气为N 2，流量为40m L/min 和25m L/min ,H 2柱前压分别为88.26kPa 和73.55kPa ，空气柱前压为10
2.95kPa 和88.26kPa.
1.4.2 纤维素剩余量测定 将培养液经500r/min 离心5min 后，用8%甲酸10m L 处理沉淀物，然后用定性滤纸过滤，过滤时用250m L 蒸溜水分数次冲洗，将滤纸置于57℃下烘干至恒重.
1.4.3 培养液还原糖浓度测定 取1m L 培养液经10000r/min 离心后，用3,52二硝基水杨酸比法测定.
1.4.4 细菌生长量与pH 用血球计数板测定细菌总数表示细菌生长；用SP M 210A 数字酸度计测定.2 结果与分析
2.1 E VA4菌株直接转化纤维素产生乙醇的动力学特性
2.1.1 E VA4菌株纤维素降解的生物学特性 E VA4菌株以纤维素滤纸或微晶纤维素粉作为唯一碳源生长
时，一般经历12～36h 的停滞期.停滞期的长短与接种物状态、θ/℃,pH 0，营养条件，氧化还原电位等因子有
关.纤维素降解启动的标志是产气和产黄素.培养24～48h 后，纤维素滤纸出现黄斑，培养液和纤维素界面形成一层混浊的菌膜，并渐渐扩散使整个培养液变混浊；同时，滤纸上的黄斑渐渐扩散至整张滤纸.镜检可观察到纤维素降解细菌和纤维素的粘附，杆状菌体一端着生芽孢，另一端与纤维素连接，数十个或上百个菌体整齐排列在纤维素条上.培养48～72h 后，细菌生长量达到最大值，滤纸溃烂.一般培养120h ,pH 下降至5.5左右，到达发酵终点.
2.1.2 E VA4菌株转化纤维素产乙醇的动力学 接种30个厌氧瓶(含30m L 培养基,2%微晶纤维素粉为碳源)，分别培养0～9d ，每24h 取出3个厌氧瓶,4℃保存.10d 后测定不同培养时间培养基的乙醇浓度(
ρeth /mg
L -1)，纤维素降解率(r cellul./%)和还原糖浓度(ρred.sug /mg L
-1).结果表明(图1，图2),E VA4菌株以微晶纤维素为唯一碳源生长过程中，乙醇浓度，纤维素降解率和培养液还原糖浓度均随培养时间的延长而增加.培养72h 内增加趋势较为明显；培养96h 之后，乙醇浓度和纤维素降解率增长缓慢.乙醇浓度维持在350～380mg/L ，微
171Suppl 韩如 等：嗜热厌氧细菌Clostridium sp.E VA4菌株直接转化纤维素产乙醇的研究
晶纤维素降解率为25%～33%；还原糖浓度不断积累，培养120h 为115mg/L ，培养至216h 为360mg/L.这是由于E VA4培养96～120h 后，细菌纤维素降解作用几乎停止，乙醇浓度不再增加；而游离于培养液中的纤维素酶继续水解一部分纤维素生成还原糖，从而使还原糖不断积累
.
图1 E VA4菌株纤维素降解(r )和产乙醇(ρ
)的动力学Fig.1 K inetics of cellulose degradation (r )and ethanol
刃天青production (ρ)by strain E
VA4图2 E VA4菌株还原糖积累的动力学Fig.2 K inetics of reducing sugars accumulation by strain E VA4
2.2 E VA4菌株利用不同碳源产乙醇能力的比较
E VA4菌株的基质谱极为广泛(图3)，除了纤
维二糖，葡萄糖等可溶性小分子糖类和纤维素滤
网格化纸，微晶纤维素等纯净纤维素外,E VA4菌株能直
接利用多种天然植物纤维素产生乙醇.结果(图
3)表明,E VA4菌株利用不同的纤维素材料产生乙
醇量从大到小依次为：纤维素滤纸，微晶纤维素
粉，纤维素M N300，纤维素粉Whatman CF II ，纤维
二糖，玉米秆内芯，甘蔗渣，葡萄糖，水稻秸秆，羧
甲基纤维素钠.利用滤纸产生乙醇量可达1123
mg/L ，滤纸降解率为59%.
E VA4菌株利用玉米秆芯和甘蔗渣时启动较快，培养12～24h 后开始产气,48h 后培养基变混浊.底物浓度较低时(小于0.5%)，培养180～240h ，几乎所有的玉米秆内芯被降解.该菌株较难利用玉米叶和水稻秸秆，培养96～120h ，玉米叶才
开始软化并出现破洞.该菌株利用天然植物材料
产乙醇的能力(250～300mg/L )要远低于滤纸(1123mg/L )
.
图3 E VA4菌株利用不同底物产乙醇的比较Fig.3 C om paris on of ethanol production from different
substrates by strain E VA4
1葡萄糖G lucose ;2纤维二糖Cellubiose ;3纤维素滤纸Cellulose
filter paper ;4微晶纤维素M icrocrystalline cellulose ;5纤维素M N300
cellulose M N300;6Whatman CF II ;7C MCNa ;8玉米秆芯M aize stem
core ;9玉米叶M aize leave ;10水稻秸秆Rice straw ;11甘蔗渣Sug 2
arcane residue E VA4菌株在纤维二糖和葡萄糖培养基中生长良好，利用葡萄糖时滞留期比利用滤纸和纤维二糖时延长24～48h ，在1%羧甲基纤维素钠培养基生长较弱.
2.3 E VA4菌株直接转化纤维素产乙醇的最适条件和影响因子
2.3.1 温度(θ/℃) 将培养物接种后分别置于θ/℃35,40,45,50,55,60,65,70，和75下培养.结果(图4)表
明,E VA4菌株直接转化纤维素产生乙醇的温度范围为45～60℃，最适温度为55～60℃.45℃培养96～120h 后滤纸才出现黄斑，继续培养，纤维素降解仍然极其缓慢，镜检观察可见菌体粗长，芽孢巨大.温度高于65℃，纤维素不能降解.
2.3.2 初始pH (pH 0) 配制不同pH 的1%纤维素滤纸为碳源的培养基，灭菌后测定pH.接种后57℃培养120h.结果(图5)表明，初始pH 小于6.2时，纤维素无法降解.初始pH 为6.2～6.8时，滤纸降解不完全，培养120h 滤纸表面起毛，软缩于培养瓶底，降解率为25%～50%，乙醇浓度仅为125～600mg/L ；即使继续培养，滤
2
71 应用与环境生物学报 5卷
纸不再降解.初始pH 为6.8～8.0时滤纸完全溃烂，降解率达75%～88%，乙醇浓度可达700～900mg/L.初始pH8.0～8.9可使该菌株滞留期延长，但降解启动后，仍能维持较高的降解速率和降解率.培养120h 后产乙醇浓度为300～500mg/L ；继续培养至168h ，乙醇浓度可上升至600～800mg/L (图6).可确定E VA4菌株转化纤维素产乙醇的最适初始pH 为7.5～8.
0.
图4 温度对E VA4菌株产乙醇的影响
Fig.4 E ffect of tem perature on ethanol
production by strain E VA4 2.3.3 底物浓度 配制不同底物浓度的培养基，使
微晶纤维素的ρ/g L -1分别为0,0.5,1,1.5,2,2.5,3,4,
8；接种后57℃培养120h.E VA4菌株降解微晶纤维素
产生乙醇量随底物浓度增大而增大(图7).微晶纤维素
浓度小于1g/L 时，几乎完全降解，但是产乙醇量较少.
微晶纤维素浓度较大时(>5g/L )，产乙醇量增大趋势
减缓.底物浓度5g/L ～50g/L 时，乙醇浓度可维持在生育健康网
570～630mg/L.底物浓度为50g/L 时产乙醇量最大，为
633mg/L.2.3.4 酵母粉浓度 酵母粉有利于该菌株降解纤维素.高浓度的酵母粉能大大缩短滞留期.8g/L 处理
培养6～12h 时开始强烈产气.1.
5g/L 处理培养24h
图5 pH 0E VA4菌株纤维素降解和产乙醇的影响
Fig.5 E ffect of initial pH on cellulose degradation
and ethanol production by strain E VA4图6 pH 0值对E V A4菌株在不同培养时间产乙醇影响的比较Fig.6 E ffect of initial pH on ethanol production by strain E VA4in different incubation time
才开始产气，此时8g/L 处理的滤纸已经溃烂.不加酵母粉的处理滤纸不能被降解.培养液乙醇浓度随酵
母粉浓度增大而增大(图8)，酵母粉浓度大于2g/L 时，增大趋势减缓.K.Sato 等研究表明，酵母粉能增加 C.ther 2mocellum I 212B 菌株的乙醇产量，但对C.thermocellum AT CC27405和JW20菌株却没有影响[2].贺延龄等研究表明，增加酵母粉含量可提高 C.celluflavus 的产乙醇量，但酵母粉浓度过高时，乙醇和乙酸浓度比下降[3]
.可确定E VA4菌株转化纤维素产乙醇的酵母粉最适用量为2～3g/L.
图7 底物浓度对E VA4菌株产乙醇的影响
Fig.7 E ffect of substrate concentration on
ethanol production by strain E VA4图8 酵母粉浓度对E VA4菌株产乙醇的影响Fig.8 E ffect of yeast extract concentration on ethanol production by strain E VA4
2.3.5 振荡 培养物接种后分别静置培养，静置培养24h ,48h ,72h 后开始每4h 利用振荡器振荡t =30
371Suppl 韩如 等：嗜热厌氧细菌Clostridium sp.E VA4菌株直接转化纤维素产乙醇的研究
s ,120h 培养后测定.结果(图9)表明，静置培养纤维素降解率比振荡培养的高10%～20%；培养72h 后开始间歇振荡培养产乙醇量(1138mg/L )比静置培养(903mg/L )高27%.这是由于静置使纤维素降解细菌和纤维素保持粘附状态，从而维持其降解能力；强烈振荡破坏粘附状态.培养72h 纤维素降解率和培养液还原糖浓度远远超过培养24h 和48h 的值，此时开始振荡培养，尽管破坏粘附状态，细菌仍能利用培养液小分子糖类产生一定量的乙醇；振荡亦使培养液H 2和C O 2浓度降低，减少其代谢抑制作用.
2.3.6 气相 结果(图10)表明，气相100%的H 2产乙醇量大于100%的N 2,100%的C O 2产乙醇量明显小于其它处理；但100%的H 2比100%的N 2的滞留期延长24h ,100%的C O 2的滞留期更长.R.J.Lamed 等研究表明,H 2可增大 C.thermocellum 代谢产物乙醇和乙酸浓度比[4].可见,H 2虽对纤维素降解有抑制作用，但可提高乙醇浓度;C O 2不利于该菌株转化纤维素产乙醇
维纳滤波.
图9 不同振荡方式对E VA4菌株纤维素降解和产乙醇的影响
Fig.9 E ffect of different stirring ways on cellulose degradation
and ethanol production by strain E VA4
1静置培养stable ;2静置培养24h 后振荡stirring after 24h stable
incubation ;3静置培养48h 后振荡stirring after 48h stable incuba 2
tion ;4静置培养72h 后振荡stirring after 72h stable
incubation 图10 气相对E VA4菌株产乙醇的影响Fig.10 E ffect of gas phase on ethanol production by strain E VA41100%N 2;2100%H 2;3100%CO 2;450%N 2+50%H 2;550%N 2+50%CO 2;650%H 2+50%CO 2
中小企业私募债试点2.3.7 外加氧气和乙醇 气相φ(O 2)>10%或液相乙醇ρ>3g/L 时，纤维素降解无法启动；低于这两个值时，滞留期随φ(O 2)和乙醇ρ/g L -1的增加而延长.一旦纤维素降解启动.φ(O 2)不影响产乙醇量.
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71 应用与环境生物学报 5卷
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