洒威;焦迎春;尹瑶;元王涛
【摘 要】在青藏高原地区的低温条件下通过滚管技术分离了一类耐低温产甲烷菌,并利用气相谱法测定了产气活性.结果表明:这类甲烷菌最低产气温度为8℃,甲烷气体产生的高峰期在厌氧培养的第7d;pH值与盐浓度对其产气活性均有影响,最佳条件为pH值7.0、盐度4%.%The methanogen was isolated by the rolling tube technique of low temperature in Qinghai-Tibet Plateau. The activity of methane production was determined with the gas phase chromatography. The results showed that the minimum temperature of methano-gens was 8 ℃ , the seventh day in the anaerobic culture was peak time of methane; the pH and salinity influenced the activity of methane production. The optimal culture condition was at pH7. 0 and salinity of 4% . 刃天青【期刊名称】《生物学杂志》
【年(卷),期】2012(029)004
【总页数】3页(P30-32)
【关键词】产甲烷菌;厌氧;低温;气相谱
【作 者】洒威;焦迎春;尹瑶;元王涛
【作者单位】青海大学生物科学系,青海,西宁,8100016;青海大学生物科学系,青海,西宁,8100016;青海大学生物科学系,青海,西宁,8100016;青海大学生物科学系,青海,西宁,8100016
【正文语种】中 文
【中图分类】Q93-3
青海地处青藏高原，气温常年偏低，尤其是冬季平均气温不到10℃，寒冷气候持续时间长，沼气池长期处于低温状态，沼气微生物的产气性能低弱，实际沼气转换率低，发酵原料的产沼气潜力得不到充分发挥而被浪费，全年沼气池利用率低，制约了广大农村牧区沼气使用的推广和普及[1]。为了提高沼气池发酵原料的分解利用率和产气量，国内外都十分
注重在沼气池内保持较多的产甲烷菌，探索选育适宜在低温条件发酵产气的微生物，繁殖培养接种到沼气池，无疑是解决冬季产气量低的重要途径之一[2]。笔者在青海寒冷地区分离筛选出一类耐低温的产甲烷菌并在实验室条件下驯化该低温菌，同时进行人工培养繁殖，探索其高效优越的产沼气系统条件，以期为提高青藏高寒地区农村沼气在低温条件时的产气量提供试验依据，为菌种推广应用提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 样品
样品采于青海贵德县越冬中温发酵沼气池，时间为2010年12月下旬，发酵原料为秸秆和牛粪。在严格厌氧灭菌条件下取样并将取回的样品密封于4℃冰箱中保存。
1.2 培养基
K2HPO40.4 g/L，NH4Cl 1.0 g/L，KH2P040.2 g/L，MgCl20.1 g/L，半胱氨酸0.5 g/L，酵母膏2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，甲酸钠5.0 g/L，甲醇溶液3.5 mL，胰蛋白胨2.0，H2和CO2(2∶1)的混合物，1%刃天青2.0 mL，pH值7.0。液体培养基配好后煮沸3～5 min，121
℃灭菌20 min，培养基在使用前每4.5 mL营养培养基中加入无菌的5%的NaHC03和1%Na2S各0.1 mL[3]。
1.3 菌种的分离纯化——滚管技术[3-4]
在厌氧培养箱中取对数生长期的培养液做10倍系列稀释后作为滚管接种物。将装在试管中的固体培养基还原，每支试管接入0.2 mL不同稀释度的菌液，立即用橡胶塞封紧，保证试管中的厌氧环境，随后迅速在冷水中滚动试管，使培养基均匀的凝固在试管壁上。滚管后的试管置于厌氧箱的内置培养箱12℃培养3～7 d，可见凝固在试管壁上的培养基中生长出均匀的单菌落。
1.4 甲烷量的测定——气相谱法[5]
谱条件：热导检测器，进样口温度为100℃，柱温为40℃，热导检测器温度为180℃，柱流速度3 mL/min，桥流50 mA，衰减1 的条件下。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
图1 甲烷气体气相谱标准曲线图Fig 1 Standard curve
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2 结果与分析
2.1 低温甲烷菌的分离纯化
在厌氧和低温条件下利用滚管技术对此菌种进行分离纯化，将10倍系列稀释度菌液经过滚管，然后放在12℃培养箱中进行培养，并逐日观察，待出现菌落后在荧光显微镜下观察，发现有稀疏发蓝绿荧光的菌体，用记号笔将其菌体标记，在厌氧操作台中进行菌落的挑取，分离到了两类典型的有荧光菌落，一类是八叠球菌形态，另一类是单球体形态，细胞的个体形态很类似，后重复3次，最终得到是高浓度的产甲烷球菌属。在厌氧培养箱中将菌液压片，放在荧光显微镜下进行观察，因为产甲烷细菌最显著的特征之一是含有独特的辅酶F420和F430，它们在荧光显微镜(氧化态)下能发出黄绿或蓝绿的荧光，因此可作为判断是否存在甲烷菌的依据[6-8]。
2.2 最低产气温度的确定
在不同的温度下，将分离的甲烷菌厌氧培养7 d后，分别取样20 μL进行气相谱法测定甲烷气体含量。结果表明，在一定的温度范围内，甲烷菌的产气活性随温度的变化而变化，
温度越高，其产气活性越高，峰面积越大，产气量越多，其最低产气温度为8℃，低于此温度检测不到甲烷气体的含量。
图2 产甲烷菌荧光镜检图(放大100倍)Fig 2 Methanogen under microscope fluorescent(100×)
标准化建设表1 最低产气温度的确定Table 1 The determination of lowest temperature for gas production温度(℃)Temperature峰面积Peakarea体积分数(%)Volumefraction产气量(μL)Gasproduction1293105679 015 81189235776 015 21084975972 514 5980905670 013 9877796167 013 47000
2.3 甲烷菌生长曲线的测定
在8℃低温环境下对甲烷菌进行培养，连续10天测定气其产气量。结果显示，产气量在第7 d达到最高值，此时也是甲烷菌生物量最高期，产气速度也最快，之后产气量基本维持在相对稳定的水平，不再增加。对应菌体的生长，1～3 d是调整期，4～7 d菌种进入对数期生长，第7 d以后到稳定期。
图3 产甲烷菌生长曲线图Fig 4 Growth curve
2.3 pH值对甲烷菌活性的影响
由表2可知，当产甲烷菌的培养基pH值为7.0，产气量为13.4 μL，若pH值小于7.0，产气量依次递减，若pH值大于7.0，产气量也依次递减。
2.4 盐度对产甲烷菌活性的影响
古老的歌谣由下表可知，当产甲烷菌的培养基盐度为4%，产气量为16.3 μL，若盐度小于4%，产气量依次递减，若盐度大于4%，产气量也依次递减。盐度大于6%，产甲烷菌不再产气。因此，此类产甲烷菌的最适pH值为7.0，最适盐度为4%。
表2 不同pH值条件下的产甲烷菌活性Table 2 Effect of pH on microbe activitypH值峰面积Peakarea体积分数(%)Volumefraction产气量(μL)Gasproduction6 00006 530247829 55 97 077796167 014 17 558245651 510 38 042247939 07 8
表3 不同盐度条件下的产甲烷菌活性Table 3 Effect of salt concentration on microbe activity热处理手册
盐度(%)峰面积体积分数(%)产气量(μL)077796167 013 4180943269 513 9285233673 014 6390455577 015 4496233581 016 3540233637 57 56000
3 结论与讨论
3.1 结论
本试验在12℃的低温环境下对产甲烷菌进行了富集培养，主要控制两个条件：12℃的低温和严格的厌氧环境，利用滚管技术将产甲烷菌分离出来，并用于后面的试验。此次试验主要是将甲烷球菌属分离出来，研究最低产气温度等影响甲烷菌产气活性的因素。结果表明，在厌氧环境和12℃低温条件下分离出来的产甲烷菌具有较高的产甲烷能力；此类产甲烷菌的生长周期在7 d左右，分离得到的甲烷菌最低产气温度为8℃，其产气量13.4 μL；在发酵条件为pH值7.0、盐度为4%时，产气量最高，分别为14.1 μL和16.3 μL。
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