投入产出法
第49卷第9期2021年5月
广州化工
Guangzhou Chemical Industry
Vol.49No.9
May.2021
张文迈，梁震
（武汉工程大学化学与环境工程学院，湖北武汉430205）
摘要：采用贵州“喀斯特”地貌中受独山鋪矿污染的稻田土样品，构建了实验室尺度的微宇宙体系，结合土壤中总DNA 的提取和高通量测序结果，研究培养期内鋪形态变化与微生物菌种落数量变化的关系。结果显示，微生物可以通过氧化三价鋪来获取能量，同时减轻伊的毒性，培养期间第5~10d内Sb（DI）可完全转化为Sb（V）；其中根据绝对丰度筛选出的6种门水平上微生物和20种属水平上微生物均为厌氧条件下错自养氧化细菌。 关键词：備污染稻田土；微宇宙体系；備形态；微生物种。
中图分类号：X53文献标志码：A文章编号：1001-9677（2021）09-0092-03 Changes of Antimony Forms and Soil Microbial Community
Structure in Microcosm
ZHANG Wen-mai,LIANG Zhen
(School of Chemistry and Environmental Engineering,Wuhan Institute of Technology,
Hubei Wuhan430205,China)
Abstract:A laboratory scale microcosm system was constructed by using paddy soil samples polluted by Dushan antimony mine in Guizhou karst landform.The relationship between the changes of antimony speciation and the number of microbial communities during the incubation period was studied by combining the results of total DNA extraction and high -throughput sequencing.The results showed that microorganisms can obtain energy by oxidizing trivalent antimony and reduce the toxicity of antimony.Sb(HI)can be completely converted into Sb(V)within5~10days of culture.Among them,according to the absolute abundance,6kinds of microorganisms at the phylum level and20kinds
of microorganisms at the genus level were antimony autotrophic oxidizing bacteria under anaerobic conditions.
Key words：antimony contaminated paddy soil；microcosm system；antimony form；microbial population.
随着工农业的发展，大量重金属伊通过各种途径进入土壤，植物对镣具有一定的富集能力⑷，水稻能吸收累积土壤中的铮⑵，对动物和人体将产生潜在的危害⑶。不同价态铮化合物的毒性大小顺序为：sb（o）＞sb（m）＞sb（v）[4]0三价伊的毒害远重于五价鋪。sb（m）与红细胞具有高亲和性，其毒性是Sb（V）的10倍左右。Sb2O3被认为是致癌物质⑷。急性鋪中毒的症状主要有肚子痛、脱水、肌肉痛、尿血、呕吐、心肌炎、肌肉坏死、肾炎、肝硬化等0。铸化合物还可刺激人体呼吸道，引发肺尘炎和其他一些疾病切。因此重金属铸污染土壤等环境问题引起了科研工作者的广泛关注。
生物对镖的吸收和吸附过程取决于铸的形态和微环境如微生物，溶解三价镖很容易被植物根系吸收，而五价铸则很难被吸收⑷。微生物是驱动地表系统中关键元素地球化学循环的引擎。自然界中的微生物可以在极高铸浓度下生长，甚至可以利用这种元素作为能源物质叨调节铸的氧化还原。而铸的移动性和毒性受到氧化还原反应的影响，反向影响微生物的生理活动，进而对其他元素的变化过程产生间接影响。因此以铸自养氧化细菌为研究对象，寻微宇宙体系中鋪形态变化与微生物落数量变化之间的规律具有一定的研究意义。
1实验
1.1仪器与试剂
土壤样品来自贵州省黔南布依族苗族自治州独山县位于东经107。33'48"、北纬25°47,23,,（气压为907.8hPa，海拔为913m）的一处被鋪矿污染的稻田土。
强力土壤DNA提取试剂盒、引物27F-FAM和1492R、PCR Master Mix溶液、琼脂糖粉末、DNA定量Marker、上样缓冲液Loading buffer，漠乙锭荧光染料、刃天青和ddl^O等。
MP Fast Prep-24型快速核酸提取仪；sigmal-14型小型高速离心机；Vortex-Genie2型漩涡振荡器；WELVAC210型抽滤机；伯乐C1000型高性能双槽双梯度PCR仪；ThermoDNA浓度测定仪；JY300C水平电泳仪。
1.2实验方法
采取污染区的土壤建立微宇宙体系，经历饥饿期之后加入无机碳源、三价铮、硝酸根模拟简化的厌氧体系。厌氧条件
第一作者：张文迈（1995-），女，硕士研究生，研究方向：水污染控制。通讯作者：梁震，博士，副教授，主要从事水污染控制研究。
第49卷第9期张文迈，等：微宇宙体系中铸形态及土壤微生物落结构变化研究93
下，微生物使用CO/HCO-）作为碳源，同时使用三价铢作为该体系中的电子供体，硝酸根作为该体系中的电子受体参与反应。培养时间内，取样节点分别为0d、3d、5d、7d、10d、16d、22d o运用原子荧光法测定不同形态铸含量，到铸含量变化趋势，同时运用强力土壤DNA提取试剂盒提取土壤样品微生物总DNA，将实验产物进行高通量测序。体系构建见表1，体系量见表2。
表1微宇宙体系构建
Table1Construction of Micro-universe System
处理组体系平行备注1NaHCO3+Sb(HI)+NO3+soil3实验组2NaHC03+Sb(IH)+soil3NO'空白组3NaHC03+N03+soil3Sb空白组
表2体系量
Table2System quantity
处理组Soil/mL MSM/mL NaHC03/mL刃天青/|±L Sb(HI)/mL NOg/mL水/mL 1327.60.630 1.20.6-2327.60.630 1.2-0.6 3327.60.630-0.6 1.2
表2中，MSM体系由氯化鞍0.435g、磷酸二氢钾2.175g、十二水合磷酸氢二钠15.31g、维生素15mL和1450mL去离子水组成。
2结果与讨论
2.1Sb（v）与sb（in）含量测定
应用原子荧光法测定铸含量［⑹，得到多个取样时间点下不同形态的铺的浓度，sb（in）和sb（V）浓度变化趋势如图1和图2。在培养期间第5〜10天之间三价铸的含量会被降到最低，而五价铸的含量会达到最高，且均会在一定的浓度水平上保持不变。说明三价領已被氧化为五价铸，且整个体系中保持平衡，毒性降低。加入了硝酸根的实验组的铢形态变化趋势较未加硝酸根的实验组缓慢，可能是由于有些菌种在硝酸根存在的情况下比较活跃，优先利用其他的更加容易利用的电子供体，从而减缓了铸的消耗速率。2.2高通量测序结果分析
2.2.1门水平上的微生物种分析
对样品进行高通量测序平台的测序后，过滤掉低质量的序列，并对微生物落丰度进行了降序排序，默认为4000以上的丰度高，选取前六种门水平上的微生物落进行分析，这六种门水平上的微生物落分别为Proteobacteria（变形杆菌）、Chloroflexi（绿弯菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌）、Acidobacteria （酸杆菌门）、Chlorobi（绿菌门）和V errucomicrobia（疣微菌门），如图3所示。
45000
Q
U
U
E
P
U
n
q
E
(TV 血±)
、u o
*l—I I E J I U O O U O O
+Eqs
40000-
35000-
30000-
25000-
20000-
15000-
10000-
5000-
510
NaHg+Sb+NO；
-■-NaHCO3+Sb
o
I
o
■
25
-
20
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5
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t/d
图i sb(Di)浓度变化趋势图
Fig.1Trend diagram of Sb(iii)concentration change
(t
7
m±)
、u
.21
咸阳偏转集团公司e.
i1
u
图2Sb(V)浓度变化趋势图
Fig.2Trend diagram of Sb(V)concentration change
图3门水平上的6种微生物种绝对丰度图Fig.3Absolute abundance map of six microbial populations
at the gate level
整个体系中，毒性降低可能会影响某些微生物，使其更容易生存。这些微生物利用铢作为其电子供体消耗铢。若三价铢含量高，窗氧化细菌对其可利用性较高，则该细菌数量变多。在第16天左右，铸的含量均达到整个过程中最低或最高，体系内能量耗尽，无可提供菌种生命活动的物质，部分菌种死亡。另外，微宇宙体系中有食腐菌，食腐菌会吃掉死去的微生物尸体之后，它们又迅速生长。这说明微生物驱动铸氧化过程，这六种门水平上的菌种均被厌氧条件下铢的氧化过程所作用，且均为厌氧条件下铸自养氧化细菌。
2.2.2属水平上的微生物落分析
对样品进行高通量测序平台的测序后，过滤掉低质量的序列，并对微生物落丰度进行了降序排序，选取了前二十种属水平上的微生物落进行处理分析，这二十种门水平上的微生物落分别为Bacteroidetes-Blvii28（拟杆菌-Blvii28）、Chloroflexi-Anaerolinea（绿弯菌一Anaerolinea）、Firmicutes-Desulfosporosinus（厚壁菌门一Desulfbsporosinus）、Firmicutes
一
94广州化工2021年5月
Fusibacter（厚壁菌门-Fusibacter）、Nitrospirae-Nitrospira（硝化螺
旋菌门-硝化菌）、Nitrospirae-HB118（硝化螺旋菌门-HB118）、
Proteobacteria-Sphingomonas（变形杆菌-鞘氨醇鞘氨醇单胞菌）、
Proteobacteria-Acidovorax（变形杆菌-食酸菌属）、Proteobacteria-
Hydrogenophaga（变形杆菌-噬氢菌属）、Proteobacteria-
Paucibacter（变形杆菌-Paucibacter）、Proteobacteri-Thiomonas
（变形杆菌-硫单胞菌属）、Proteobacteria-Ralstonia（变形杆菌-
罗尔斯通菌属）、Proteobacteria-Gallionella（变形杆菌-披毛菌
属）、Proteobacteria-Thiobacillus（变形杆菌-产硫酸杆菌）、
Proteobacteria-Methylotenera（变形杆菌-Methylotenera）、
Proteobacteria-Vogesella（变形杆菌-Vogesella）、Proteobacteria-
Dechloromonas（变形杆菌-Dechloromonas）、Proteobacteria-
Desulfococcus（变形杆菌-脱硫球菌属）、Proteobacteria-Geobacter
（变形杆菌-地杆菌属）、Proteobacteria-Pseudomonas（变形杆菌-
假单胞菌）等，如图4所示。其中Proteobacteria变形杆菌门的刃天青
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属水平上的微生物落种类较多，故变形杆菌为培养过程中微
宇宙体系中的优势菌。
o O U E P U n q E
Chloroflexi-Anaerolinea
Firmicutes-Desulfosporosinus
F i rmicutes-Fusibacter
N i trospirae-N i trospira
Nitrospirae-HBl18
Proteobacteria-Sphingomonas
Proteobacteria-Acidovorax
Proteobacteria-Hydrogenophaga
Proteobacteria-Paucibacter
Proteobacteri-Thiomonas
Proteobacteria-Ralstonia
Proteobacteria-Gallionella
Proteobacteri a-Th i o baci11u s
Proteobacteria-Methylotenera
Proteobacteria-Vogesella
Proteobacteria-Dechloromonas
Proteobacteria-Desul l ococcus
Proteobacteria-Geobacter
Proteobacteri a-Pseudomonas 图4属水平上的20种微生物种绝对丰度图
Fig.4Absolute abundance map of20microbial populations
at genus level
观察发现，某天某种属的丰度骤然变高，说明该条件下的铸浓度适宜该种属生长，部分种属数量上升后不再下降则说明備浓度和毒性达到了适宜该种属的生存的条件。在第16天左右，铸的含量均达到整个过程中最低或最高，体系内能量耗尽，无可提供菌种生命活动的物质，部分菌种死亡。另外，微宇宙体系中有食腐菌，食腐菌会吃掉死去的微生物尸体之后，它们又迅速生长。这说明微生物驱动铸氧
化过程，这二十种属水平上的菌种均被厌氧条件下铸的氧化过程所作用，且均为厌氧条件下铸自养氧化细菌。
3结论
土壤重金属污染和修复治理一直是国内外的研究热点，本论文以贵州“喀斯特”地貌中受独山铢矿污染的稻田土为研究对象，通过建立实验室微宇宙体系，运用测定铺含量的原子荧光法、提取土壤中总DNA技术和高通量测序等技术，研究了铸形态变化的大致趋势和每个培养时期微生物菌种落数量的大致变化，简单地分析了高通量测序结果，到了铸形态变化与微生物落数量变化的对应规律。
（1）微生物广泛参与了铢的地球化学循环，微生物可以通过氧化三价铢来获取能量，同时减轻铢的毒性；
（2）微生物驱动的铢氧化作用，能够明显地提高窗的氧化速度；
不确定度
（3）Proteobacteria（变形杆菌）、Chloroflexi（绿弯菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌）、Acidobacteria（酸杆菌门）、Chlorobi（绿菌门）和Veirucomicrobia（疣微菌门）这六种微生物为门水平上的厌氧条件下铢自养氧化细菌；
（4）Bacteroidetes-Blvii28（拟杆菌-Blvii28）、Chloroflexi-Anaerolinea（绿弯菌一Anaerolinea）、F
irmicutes一Desulfbsporosinus （厚壁菌门-Desulfosporosinus）、Firmicutes-Fusibacter（厚壁菌门-Fusibacter）、Nitrospirae-Nitrospira（硝化螺旋菌门-硝化菌）、Nitrospirae-HBl18（硝化螺旋菌门-HB118）等二十种微生物为属水平上的厌氧条件下舗自养氧化细菌。
参考文献
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