免疫组化（IHC）│常见问题及解析集锦
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免疫组织化学（简称免疫组化）是组织化学的一种，它是利用已知的特异性抗体或抗原能特异性结合的特点，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等，显示一定的颜，并借助显微镜观察其颜的变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的化学成份或化学性质。 实验过程包括切片制作（固定，脱水，透明，包埋，切片，贴片，烤片），脱蜡，水化，阻断，抗原修复，封闭，一抗孵育，二抗孵育，显，复染，封片，分析。
实验过程常见问题如检测结果阴性，非特异性染，染强度不够，着不均，脱片，干片等。一起来看案例解析，助您高效做出准确实验结果。
1 标本的固定
常见问题：
组织固定不及时或不完全固定,HE染细胞核发灰模糊，对比不鲜明；免疫组化染结果不理想，通常组织离体2h后抗原完全丢失。
01范例1
检测组织：人淋巴结组织石蜡切片
检测：CD45染
问题：组织固定不充分，淋巴结边缘淋巴细胞CD45染强阳性，组织内部淋巴细胞CD45染弱阳性，染不均。
02范例2
检测组织：肾脏组织石蜡切片
检测：HE染劳动政策
问题：固定不及时或固定不完全，细胞核模糊，对比不鲜明。
建议：
1、组织离体后尽快固定，组织块大小为15×15×5mm，切开固定效果好；
2、固定液以10％中性福尔马林缓冲液为佳；
3、固定时间在4h-24h之间，长时间固定会影响抗原决定簇的暴露，产生阴性结果；
4、固定液的量要超过组织体积5倍以上。
故障树分析2 标本的取材，脱水，浸蜡
常见问题：
如果组织脱水、浸蜡不充分，蜡块会出现组织收缩凹陷，而且在免疫组化热抗原修复操作时会容易脱片。
建议：
1 梯度酒精脱水尽量彻底充分；
2 二甲苯透明时间不宜长，1～3h为佳，透明过度会导致组织发硬发脆；
3 浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应充分。
3 标本的切片，捞片，烤片
常见问题：
切片太厚，有刀痕，有褶皱，脱片。
01范例1
问题：
有刀痕，影响结果的判读。
02范例2
左：乳腺癌组织石蜡切片，Mammaglobin染阳性，脱片，烤片时间不足。
右，乳腺癌组织石蜡切片，MUC6染阴性，烤片时间充分。
建议：
1 切片厚度视组织而定，如同淋巴结、肾等需要比较薄（不超过3um），脑组织需要较厚（尤其是取新鲜标本冰冻制片时），常规都要6-8um最佳，冰冻可切至10um；其他一般如胃肠道、肝胆等等组织，2-4um均可,太厚易掉片，细胞重叠，影响观察。切片角度和刀片新旧程度对切片效果的影响较大，切片角度视切片机型号而异；新刀片容易切出完好的切片。
2 捞片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在40℃左右。
3 粘片时需准备蛋白甘油，蛋白甘油由鸡蛋蛋清和甘油调配而成，比例为1：1。 先将一滴蛋白甘油涂抹在干净的载玻片上，然后用载玻片从水中将展好的蜡片捞起，平放入烘箱内进行烘干。或者玻片用防脱片或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性。
4 烘干温度为50℃，时间为12～24h。
4 标本的脱蜡不完全
常见问题:
脱蜡不全,组织出现异染现象,异染现象一般是苏木素着不佳,HE染没有选择性,染不均匀。有的是伊红染不上。
建议：
根据不同的室温，调节脱蜡的时间，原则上是要彻底、干净、完全地脱去切片上的蜡。
5 抗原修复
抗原修复是免疫组化中不可忽略的关键步骤。原因是组织经福尔马林等固定液固定和石蜡包埋后，抗原决定簇与核酸易发生交联，引起蛋白质空间结构的改变，导致抗原决定簇被封闭，是抗原与抗体结合点减少，从而令抗原抗原的阳性检测率及着强度相对减弱。这种交联在高温加热或是蛋白酶水解作用下会发生可逆反应，恢复蛋白的原有构象，这一过程就是抗原修复。
常见问题：
阳性检测率及着强度相对减弱。
01PH值的影响
湖南卫视晚间新闻
不同组织，不同PH值抗原修复液其染结果强度不一样。有些抗原随抗原修复液PH值的变化，其染强度没有明显变化（A型）；有些抗原随抗原修复液PH值的升高，其染强度降低后又升高（B型），有些抗原随抗原修复液PH值升高，其染强度升高（C型）。
02举例
相同组织，不同PH值抗原修复液其结果染强度不一样。
03分享
1 抗原修复缓冲液有多种，常用的则为柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），EDTA缓冲液（pH8.0-9.0），Tris/Tris-EDTA缓冲液（pH9.0-10.0），或者胰酶法（pH3.5±0.2）；
2 修复液的不同PH值对染结果的影响比较大；
时空曲率
3 没有一种抗原修复缓冲液可以适用于所有抗原；
4 大部分抗原在修复液pH8.0-9.0的范围值可以获得一个普遍较好的修复效果，所以碱性缓冲液应用普遍些。
6 封闭
注意事项：
1 根据二抗系统中是否含有生物素而选择封闭剂。
组织切片2 无生物素的二抗系统可以不使用封闭剂，如Immunoway的RS0011通用型二抗。
3 卵白素类的二抗系统需要根据生物素的种类选择相应的封闭剂在一抗前处理组织切片。
4 封闭时间过长，会导致阳性信号减弱甚至出现假阴性。
5 封闭时间不足，会导致背景增强甚至出现假阳性。
7 洗涤
检测组织：人结肠癌石蜡组织切片
检测：CEA染
问题：染液的堆积（黑箭头区域）
建议：充分洗涤。
8 干片
检测组织：人前列腺石蜡组织切片
检测：TIMP-1染
问题：干片导致的假阴性（黑箭头区域）
建议：加入Tween-20的缓冲液能够更好地防止切片干燥。
9 边缘效应
检测组织：人扁桃体石蜡组织切片
检测：Lysozyme染
问题：边缘效应造成的非特异性染（黑箭头区域）
建议：组织切片与玻片黏贴牢固，试剂完全覆盖组织防止干片，加入Tween-20的缓冲液能够更好地防止边缘效应。
10 一抗的选择
免疫组化耗时长，步骤繁多，为了得到特异性染，获得可靠结论，选择合适的一抗十分关键。基本原则是选择选择特异性强，灵敏度高，背景低的抗体，结果稳定、重复再现性良好的抗体。
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