HPLC常见问题
HPLC常见问题和对策—对实验⼈员⼗分有⽤
HPLC⾊谱常见问题
1.⽤HPLC进⾏分析时保留时间有时发⽣漂移，有时发⽣快速变化，原因何在？如何解决？ 2.液相⾊谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？
3.HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法
4.做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？
5.我最近更换了另⼀种牌号的ODS柱，虽然分离情况仍可以，但保留时间不重现，为什么？
6.我购买的HPLC柱验收测试时柱压过⾼，请问为什么？
7.⾊谱双峰产⽣的可能及判断和处理
9.使⽤PEEK（polyetheretherketone）管路和接头需要注意什么问题？
10.液相⾊谱梯度洗脱中柱温的影响有那些？
11.为何基线会漂移
12.规则的基线噪⾳是如何产⽣的
13.不规则的基线噪⾳是如何产⽣的
14.保留时间漂移的故障排除
15.为何出现肩峰或分叉？
16.为何出现⿁峰？
17.为何出现峰拖尾？
18.为何出现峰展宽？
19.除了流速外，还有哪些因素能引起压⼒改变？
21.怎样才会使峰位发⽣重排？
22.除了在线脱⽓常⽤的实验室脱⽓⽅式还有哪些？
23.评价⼀个⾊谱柱的最基本指标有那些？
24.什么是时间常数？
25.为什么在实验过程中有时会出现倒峰？26.为何会出现“胖”峰和平头峰？怎样避免？
27.什么是次级保留效应？
28.前延峰的发⽣及处理？
29.峰变宽的原因？
30.柱平衡慢的常见原因有哪些？
31.⽤内标法实验时对内标物的要求有哪些？
介入心脏病学
32.管⼦切割与安装注意事项？
33.什么是HPLC的“⽆限直径效应”？
34.如何评价⼀台检测器？
35.如何简单判断⽐例阀是否内漏？
1.⽤HPLC进⾏分析时保留时间有时发⽣漂移，有时发⽣快速变化，原因何在？如何解决？刚度矩阵
谱纯关于漂移问题：
①温度控制不好，解决⽅法是采⽤恒温装置，保持柱温恒定 ②流动相发⽣变化，解决办法是防⽌流动相发⽣蒸发、反应等
③柱⼦未平衡好，需对柱⼦进⾏更长时间的平衡
关于快速变化问题
①流速发⽣变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定
②泵中有⽓泡，可通过排⽓等操作将⽓泡赶出。
③流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进⾏适当混合
2.液相⾊谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什
么？
①筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱⼦，替换筛板或更换柱⼦。
②存在⼲扰峰，解决办法为使⽤较长的柱⼦，二氧化碳的排放量
改换流动相或更换选择性好的柱⼦
③可能柱超载，减少进样量。
3.HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法
①样品量不⾜，解决办法为增加样品量
②样品未从柱⼦中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱⼦
③样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器
④检测器衰减太多。调整衰减即可。
⑤检测器时间常数太⼤。解决办法为降低时间参数
⑥检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。
⑦检测池中有⽓泡。解决办法为排⽓。
⑧记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。
⑨流动相流量不合适。调整流速即可。
⑩检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
4.做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？
①泵内有空⽓，解决的办法是清除泵内空⽓，对溶剂进⾏脱⽓处理；
②⽐例阀失效，更换⽐例阀即可；
③泵密封垫损坏，更换密封垫即可；
④溶剂中的⽓泡，解决的办法是对溶剂脱⽓，必要时改变脱⽓⽅法；
⑤系统检漏，出漏点，密封即可；
⑥梯度洗脱，这时压⼒波动是正常的。5.我最近更换了另⼀种牌号的ODS柱，虽然分离情况仍可以，但保留时间不能重现，为什么？
这是因为被分析物可能具有形成氢键的能⼒。尽管过去⼏年来，填料的制造技术有了极⼤的提⾼，但不同的⼚商的ODS填料表⾯硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发⽣相互作⽤。因此，同⼀被分析物中的各组分在不同牌号的ODS柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相中加⼊少量竞争物，如三⼄基胺（TEA），将会使硅醇基的成键能⼒饱和，从⽽能保证不同牌号柱⼦上的相对保留时间具有较
好的重现性。
如分离情况可以，系统稳定，达到系统适⽤性要求，就不必保留时间的重现。
6.我购买的HPLC柱验收测试时柱压过⾼，请问为什么？
柱压过⾼是HPLC柱⽤户最常碰到的问题。其原因有多⽅⾯，⽽且常常并不是柱⼦本⾝的问题，您可按下⾯步骤检查问题的起因。
①拆去保护预柱，看柱压是否还⾼，否则是保护柱的问题，若柱压仍⾼，再检查；
②把⾊谱柱从仪器上取下，看压⼒是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压⼒下降，再检查；
③将柱⼦的进出⼝反过来接在仪器上，⽤10倍柱体积的流动相冲洗柱⼦，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进⼊流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；只⽤于使⽤过的柱⼦。
④更换柱⼦⼊⼝筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压⼒上升。若柱压还⾼，请与⼚商联系。⼀般情况下，在进样器与保护柱之间接⼀个在线过滤器便可避免柱压过⾼的问题，SGE提供的Rheodyne 7315型
过滤器就是解决这⼀问题的最佳选择。
7.⾊谱双峰产⽣的可能及判断和处理
HPLC分析中，在⾊谱柱正常，样品灵敏度⾜够，分析⽅法合适，⾊谱峰在出峰时间较短的条件下（不包括梯度），峰型应对称⽽尖锐。但是，在对样品了解程度不够，⽅法不妥，样品处理⽅法及进样⽅
式不合理下，会出现各种意想不到的问题，⽽对⾊谱峰难以作出合理的解释，尤其对于新⼿更是如此。下⾯根据本⼈⼏年⼯作的体会，提出⼀些看法，向同仁指教。
⾊谱双峰指的是明是⼀种物质，但在⾊谱图中出现双峰，⽽表明含⼆种物质。我将这种情况分为四种原因。
1 ⾊谱柱
如果你分析样品时发现每个⾊谱峰都双峰出现（出峰越快，双峰的可能性会减少），尤其采⽤单⼀纯物质时，可以肯定⾊谱柱出问题－柱头受损或柱头固定相变脏或流失。如果进样量少，原来⾊谱柱正常，⾊谱峰的形状多为⼀⼤峰带⼀⼩峰，不⼀定拖尾，这⼀般应是柱头受堵，将⾊谱柱反过来接，⽤流动相冲洗或酸洗或其它溶剂，将堵在柱头的残留物冲掉，再反过来，⼀般情况下就⾏了。当然不反冲，正冲有时也会正常的。如果峰拖尾，双峰强弱相差不⼤，柱头固定相变脏或流失可能性更⼤，这是可以将进样那头拧开，将微孔滤⽚超声，柱头刮去⼀部分填料，重新填上新填料拧紧，不过这种活，需要⼀定技术，同时不能⽼⼲那种事，否则⽤不了⼏次，⾊谱柱就会应柱效很低⽽报废。
2 溶剂极性及进样量
许多HPLC分析者对此可能不以为然，⼀般的HPLC的书籍和⽂献都不会提到这⽅⾯的内容，⽽这确是
双峰产⽣的⼀个很重要的原因。⽬前HPLC分析多为反相⾊谱，流动相多为甲醇、⼄腈、⽔，加各种添加剂以改善分离性能。样品⼀般⽤与流动相相溶的溶剂溶解。最佳的溶解⽅法是⽤流动相溶解，但是很多情况是不⼀致的。当⽤溶剂极性强度⼤的试剂，如纯甲醇、纯⼄腈，纯⼄醇，⽽分析体系中以⽔为主，样品进样量⼤，如定量管为20ul，此条件下完全可以肯定，单⼀的纯物质出双峰，第⼆峰⽐第⼀峰⼩（每次都不太⼀样），且拖尾，保留时间会提前（相对进样量少⽽⾔），将进样量减少⼀半以上，峰型将变为正常。这是样品的溶剂与流动相极性相差太⼤，⽽流动相来不及将其稀释达到平衡造成的。上⾯提到进样量造成双峰的⼀个原因，另⼀个原因是，进样量不⼀定⼤，但绝对量很⼤，⾊谱图上的双峰紧靠在⼀起，基本上齐⾼，不拖尾（如果出峰很快，也可能是⾊谱柱问题）。将样品稀释再进样就可以了，这是由于进样量过⼤，⾊谱柱过载造成的。
3 样品的特性
有些样品由于其化学结构的特点，存在互变异构现象，⽽这种互变异构体⽆法分开，⽽是以⼀个动态平衡存在。在⾊谱分析时，在⼀个特定的条件下，⼀种物质将出现双峰，双峰靠的很近，基本齐⾼，不拖尾，条件稍⼀变化，尤其pH，双峰现象将消失，如红霉素等。有的样品紫外的⾊谱图上看不到双峰，但在LC－MS下，⽤质谱检测器，其质谱的总离⼦流图上较明显，例如我分析过的农药啶⾍眯（吡⾍清）。
4 参数记录的参数⼀般都内定的，不必修改，但GC和HPLC的参数是不完全⼀致的，例如C－R3A 数据记录仪上的⼀般记录时间间隔GC为2ms，HPLC 为5ms，如果记录间隔时间缩短，⼀个峰将变为⼆个峰或更多。
8.⾊谱柱中的流动相会排⼲吗？
不少做⾊谱分离试验的⼈遇到过这样的情形：不慎未及时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸⼲了，HPLC系统由此⽽停⽌⼯作了。如此情况是否会损坏⾊谱柱？泵是否已将⾊谱柱中所有流动相都排
⼲了？⾊谱柱还能使⽤吗？事实上，如果泵将溶剂瓶中的流动相吸⼲，并不会造成⾊谱柱的损坏。即使泵中充满了空⽓，泵也不会将空⽓排⼊⾊谱柱。因为泵只能输送液体，⽽不能输送空⽓。
相⽐之下，另⼀个更可能发⽣的情况是忘记盖上⾊谱柱两端的密封盖或盖⼦太松⽽使⾊谱柱变⼲。同样，整个⾊谱柱⼲涸的情况不太容易发⽣，多半可能只是⾊谱柱两端的⼏个毫⽶变⼲了，因挥发掉所有溶剂是⾊谱柱变⼲需要相当长的时间。即使⾊谱柱真的变⼲了，也不⼀定就不可救药了。可以尝试⽤⼀种完全脱⽓的、表⾯张⼒低的溶剂（如经氦⽓脱⽓的甲醇）冲洗⾊谱柱以除去⽓体。较低的表⾯张⼒有助于浸润填料表⾯；已脱⽓的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的⽓体。⾊谱柱⼤约需要（以1mL/min的流速）冲⼀个⼩时或更多的时间被彻底浸润，恢复到正常状态。
9.使⽤PEEK（polyetheretherketone）管路和接头需要注意什么问题？
电力线上网
如果经常需要改变流路或更换不同品牌的⾊谱柱，使⽤PEEK材料制成的管路和接头会⾮常⽅便。PEEK管路容易连接；PEEK接头不仅⽆需⼯具，⼿拧即可固定，⽽且容易调节锥箍之外的管路长度，⽅便与不同品牌或规格的⾊谱柱相连接。
使⽤此类材料的管路需要注意的是：PEEK对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。虽然未观察到上述溶剂溶解PEEK材料的明显迹象，但PEEK遇到上述溶剂会变脆。另⼀个西药考虑的因素是压⼒限。不锈钢管可耐受6000psi的压⼒，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多数HPLC应⽤系统压⼒不会超过
3000psi）。
使⽤PEEK接头时则⽆需担⼼接头耐溶剂性能，因为接头⼏乎或很少与溶剂直接接触。但⼿拧固定的PEEK接头压⼒限低于不锈钢管，因⽽压⼒太⾼时，可能会使接头在管路上滑动⽽产⽣死体积或漏液。
10. 液相⾊谱梯度洗脱中柱温的影响
许多⾊谱⼯作者在操作液相⾊谱时，⾊谱柱是在室温环境下⼯作的。如果实验室的温度能保持不变的话，不会有什么⼤问题。但⼤多数的⼯作环境温度是不断变化的，因此若想将在某实验室开发的⼀种液相⾊谱⽅法应⽤到其他实验室的话，温度的差别就会引起较复杂的问题。温度的影响在所有的⾊谱分析⽅式中都是存在的，本⽂就来讨论液相⾊谱⽅法中的梯度洗脱⽅式受温度影响的问题。
等度保留
⼤多数⾊谱⼯作者知道等度洗脱时温度会影响保留时间。图1显⽰了三个不同温度下的分离结果。我们发现当温度升⾼时所有的⾊谱峰都前移了，等度洗脱时⼀般温度每升⾼⼀摄⽒度保留时间会缩短
1-3%，在图1中，保留时间变化率约为2%/℃。
拥有温控系统的实验室⼀般都有全天候温控设置，但这种设置可能引起室温显著变化，这对整夜运⾏的⾊谱系统就会有⼀些影响，例如我们实验室的夜间温度就设为4-7℃。在不同的季节，实验室的夜间温度可能⽐正常⼯作⽇的温度⾼或低，这种温度的变化就会使⾊谱峰离开“保留时间窗”，造成连续进样中产⽣⼀系列的⽆效数据。
还有⼀个可能的温度影响因素就是⾊谱仪器在
实验室的位置。当⾊谱柱正对着空调的送风⼝时，虽然整个实验室的温度⾮常稳定，但⾊谱系统的温度就会不断的变化。这就是我们要使⽤柱温箱的原因之⼀。
梯度保留
温度变化对梯度洗脱和等度洗脱的影响趋势是
⼀样的。图2是苯胺和苯酸在三个温度条件下的⾊谱图。图1中，20℃的温度变化引起保留因⼦的变化⼤约为两倍，然⽽在图2中，40℃的变化使保留改变了约20%。平均来说，图2中的⾊谱保留变化约为
0.2%/℃。由此可见，温度变化对梯度洗脱的影响要⼩于对等度洗脱的影响（假定本例具有普遍代表意义）。即便如此，若梯度洗脱时不控制温度的话，保留值⼀般都会有较⼤的变化。
选择性的变化
⽐较图1和图2会发现温度变化能引起选择性显著变化。图1中，25℃时第⼆个峰和第⼀个峰很接近，但当温度升⾼后，第⼆个峰却远离第⼀个峰，接近第三个峰。从三个图来看，对于前三个峰的最佳分离条件是35℃。值得注意的⼀个有趣现象是，选择性的变化是和成分相关的，例如图1中当温度变化后最后三个峰的相对位置⼏乎不变。
在图2的梯度洗脱⽰例中，也有选择性变化。峰1、2、4和5的相对位置没有⼗分明显的变化，但是，当温度升⾼时，峰3会移近峰4。
峰位置的相对变化和温度的变化是有规律可循的。当条件确定以后，这个规律就是可预测的。例如，在图2中当温度升⾄77℃以上时，峰3和峰4将会合并。⽽当温度更⾼时，峰3将会移到峰4之后。温度引起的选择性变化的多年来⼀直未受重视。最近，施耐德等⼈发现能够将温度作为⼀个调整选择性的
有⼒⼯具。图1中的样品在35℃时可以达到最佳选择性（峰之间的距离最⼤），⽽图2中的样品在38℃时可达到最佳选择性（这两份样品的最优温度近似纯属巧合）。
温度控制
从实践出发，图1和2的例⼦说明为了获得⼀致的结果我们必须要控制柱温，使⽤柱温箱是最好的办法。⽬前商业化的柱温箱有两种形式：直接加热⾊谱柱和通过空⽓传热，每种设计都有其优缺点，⽽且不同⼚商设计的LC系统也有不同的限制。在直接加热型柱温箱中⾊谱柱是被夹在⾦属加热器中或被加热
器包裹起来；⽽在空⽓传热型的柱温箱和⽓相⾊谱柱温箱很相像，⾊谱柱是被悬挂在静⽌或流动的空⽓中，通过加热空⽓来保持柱温。第三种设计是把⾊谱柱浸在液体中（⽐如⽔浴中），这在实验室中很容易搭建，但通常这种设计也并不⽐其他设计省
⼒。
如果没有柱温箱，最有效的办法就是将⾊谱柱隔绝在⼀个温度波动最⼩的地⽅。例如，可把⾊谱柱置于泡沫塑料套中或⾊谱包装盒中，当实验室温度基本不变时效果很好，但这种⽅法必须要允许保留有⼀些波动。隔绝⾊谱柱也可以避免结果受环境温度影响。
温度平衡
我们知道，为了保证分离的重现性，⾊谱柱在梯度洗脱状态下的必须有平衡过程。当⼀次梯度洗脱分离完成后，⼀定要⽤10-15倍柱体积的流动相来冲洗柱⼦以恢复柱⼦的平衡。例如，如果使⽤B溶剂
5-100%的梯度，柱⼦为150mm′4.6mm（柱体积为1.5ml），当流动相从100%的B溶剂换回到5%的B 溶剂时，⼤概需要保持1.5ml/min的流速10分钟来恢复系统平衡，在进⾏下⼀次梯度变换之前如果系统没有平衡，那么保留时间的重现性就会很差。
正如柱⼦不能完全平衡将导致保留时间的重现
性差⼀样，柱温不平衡也会导致不理想的后果，这个问题在峰宽上的影响尤其明显。当温度变化时除了选择性和保留时间的变化之外，峰宽也会发⽣变化。升
⾼温度通常会使理论塔板数（N）升⾼，峰宽变窄，由于峰⾯积不变，峰越窄就会越⾼，因此升⾼温度可以达到更⼩的检测限。（这篇⽂章⾥的⾊谱图不是按同⼀个y轴⽐例来画的，所以峰⾼的变化没有表⽰出来）引人入胜的书
不⽤平衡的流动相充分的冲洗柱⼦会导致化学不平衡状态，但是当柱⼦在程序升温的环境中我们怎样确定不平衡问题呢？答案取决于柱⼦中的流动相，如果柱⼦是在室温条件下，溶剂瓶、泵和⾃动进样
器也在室温下，那么整个系统中的温度就应该是稳定的。但是，如果柱⼦是热的，系统的其他部分和溶剂是室温，柱头将⽐柱尾凉。柱⼦⾥的温度变化将会影响峰形。
图3所⽰⾊谱图中柱温为38℃，进柱的溶剂为室温（约22℃），最后⼀个峰有很明显的变形。把溶剂瓶、泵、⾃动进样器加热⾄与柱温相同是不现实的，所以溶剂预热器是最好的选择。我们⽤1⽶长，
0.25mm内径的不锈钢管作为预热器，把这个不锈钢管盘成直径⼤约10cm的平⾯紧贴在柱温箱⾥的预热器上，再让流路垂直以便预热器能够位于⾃动进样器和柱⼦之间，这样，凉的溶剂从⾃动进样器⾥出来到柱⼦之前经过这个预热盘升⾼了温度。图3中的上⾯⼀个⾊谱图就是增加了预热器使峰形得到改善。有⼀些商品柱温箱就包括这个预热器。
当流动相和柱⼦之间的温差增⼤时，由温度不平衡⽽导致的峰变形就会加剧。⽐较图3-5你会发现这个问题很富戏剧性。在77℃时后⼀个峰变形很⼤以⾄于会认为它是两个成份或者认为柱⼦有了死体积。在上述情况下当使⽤了预热盘以后峰型都变得很漂亮。虽然由于⽐例不同我们⽆法看出，其实图3-5中所有对应成份的峰⾯积都是不变的。
为什么会看到这些峰变形了呢？这很容易从峰展宽的⾓度来解释。前段的温度⽐尾部的温度⾼，所以前段⾛的快。当前⾯⽐后⾯⾛的快的时候就会产⽣展宽的峰。这种现象和梯度洗脱中有种情况是相对的，就是在⼀开始使⽤弱极性溶剂⼩流速后⽤强极性⼤流速。虽然使⽤预热器来改善峰形是⼀个很著
名的结论（见参考⽂献3）但峰变形的原因仍然很复杂。在理想梯度洗脱中，每个峰都应该在相同的环境中出来⽽且以相同的速度通过柱⼦，最后得到相同的峰宽。但是很奇怪后出的峰变形问题⽐先出的峰要严重，正如图4所⽰。或许读者对这个现象会有简单的解释。
结论
我们发现柱温在液相⾊谱梯度洗脱过程中扮演
了⼀个重要的⾓⾊，⾸先，提⾼柱温可以缩短保留时间，其次，我们看到柱温还可以影响选择性，最后，温度的不平衡会导致峰扭曲变形。这些提醒我们，如果想得到稳定可靠的分离结果，⾊谱柱的温度变化是不可忽视的。
11.为何会基线漂移
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