柱前衍生化高效液相谱法准确测定
李俊峰 都婷婷 兰先秋 张义文 宋航
3
(四川大学制药与生物工程系，成都610065)
摘 要 用12萘胺对22氯丙酸进行柱前衍生化，衍生化反应在30℃条件下进行10m in 或更长时间。选择
Chiralcel OD 2H 谱柱和正己烷2醇类为流动相，考察了流动相组成和柱温的变化对22氯丙酸衍生物对映体拆
分效果的影响。确定流动相为V (正己烷)∶V (甲醇)∶V (乙醇)=50∶45∶5，流速1.0mL /m in，柱温30℃，检测波长224n m 为较优分析条件，分离因子2.5,8m in 内出峰。现有文献和试剂手册提供的22氯丙酸的比旋光度标准值之间相差很大，在实际测量和计算中无准确标准可依。柱前衍生化结合手性固定相谱方法灵敏度高，重现性好，操作较简单，可用于准确测量22氯丙酸的光学纯度，并准确给出一定条件下22氯丙酸的比旋光度
和光学纯度的对应关系([α]20
D 213.94(neat,d1.2547),e .e .97.9%)。关键词 22氯丙酸，柱前衍生化，手性固定相，高效液相谱，光学纯度
2006211216收稿;2007205209接受
本文系四川省自然科学基金资助项目(No .04JY029208323)3E 2mail:hangs ong@vi p.sina
1 引 言
芳氧丙酸类除草剂是一类重要的手性农药，其中S 型比R 型的药效低甚至无效[1]
。出于对环境保
护的考虑，欧美等发达国家已开始立法限制外消旋农药的使用[2]
。所以开发使用光学纯的手性农药势在必行。而手性农药的光学纯度高低直接和生产该农药的手性中间体的光学纯度密切相关。22氯丙酸
(22chl or op r op i onic acid )是芳氧丙酸类除草剂、植物生长调节剂以及一些杀菌剂的重要中间体[3]
。因此，检测和控制手性中间体22氯丙酸的光学纯度具有重要的意义。
目前测定手性物质光学纯度的方法主要有旋光度法和手性谱拆分法。旋光度法测量虽然受温
度、溶剂、浓度的因素影响较大[4]
，但其快速、简单的优点仍然是测量光学纯度的最常用的方法之一。
22氯丙酸在常温下为液体。在一定温度条件下，比旋光度测量值=(旋光度测量值/密度值)，光学纯度=(比旋光度测量值/比旋光度标准值)。几种试剂手册提供的比旋光度标准值和密度值之间相差
很大，如[α]20D 213.89(neat ),e .e .95.6%,d1.265[5];[α]20
D +14°
(neat ),e .e .90%,d1.249(A ldrich 试剂手册,200322004,468);[α]20
D 214°(neat ),e .e .96%,d1.270(Lancaster 试剂手册,200422005,435)。
实际测定的22氯丙酸的比旋光度与文献标准值比较所获得的光学纯度尚未有统一明确的结果。
使用气相谱(GC )拆分22氯丙酸衍生物可计算22氯丙酸的光学纯度[6]
，但衍生条件复杂。研究
表明，高效液相谱(HP LC )拆分是较准确可靠的测量对映体纯度的方法[7～9]
，柱前衍生化结合手性固
定相法是手性拆分行之有效的方法[10,11]
。据此，本研究提出了12萘胺(12naphthyla m ine )柱前衍生化法拆分22氯丙酸，并讨论了衍生化反应条件、流动相组成和柱温等对拆分效果的影响，用所建立的方法准确快速地测定了22氯丙酸的光学纯度，并确定了22氯丙酸的比旋光度和光学纯度的明确的对应关系，并应用此方法实时监测了22氯丙酸制备过程中产物光学纯度的变化，对制备光学纯度的22氯丙酸有很好的应用价值。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
LC 220AT 型高效液相谱仪和SP D 2M20A 型二极管阵列紫外检测器以及Class VP 谱工作站(日
第35卷
2007年8月 分析化学(FE NX I HUAXUE ) 研究简报Chinese Journal of Analytical Chem istry
第8期
1195～1198
本岛津公司);Chiralcel OD 2H 手性柱,250mm ×4.6mm (日本DA I CE L 公司);HCT 2360型柱温箱(天津恒奥科技发展有限公司);XRC 21型显微熔点仪(四川大学仪器厂);Aut opol I V 型旋光仪(美国RU 2DOLPH 公司);Ant on Paar DMA4500型密度仪(奥地利Ant on Paar 公司)。正己烷、甲醇、乙醇、异丙醇，国产HP LC 级；外消旋22氯丙酸，国产(含量98%);(S )222氯丙酸为自制(反相HP LC 检测化学纯度≥98%)；其它试剂均为国产分析纯。2.2 谱条件
流动相为V (正己烷)∶V (甲醇)∶V (乙醇)=50∶45∶5，流速1.0mL /m in，柱温30℃，利用波长扫描确定最佳检测波长为224n m 。所用流动相均经0.45μm 滤膜过滤并超声脱气后使用。死时间由甲醇测定。2.3 样品衍生化反应
用12萘胺与22氯丙酸反应生成22氯2N 212萘基丙酰胺(22chl or o 2N 212naphthyl p r opana m ide )。称取0.1g 22氯丙酸和0.17g 12萘胺，溶于20mL 二氯甲烷，加入0.247g EE DQ (22Ethoxy 21,22dihyd
解子征r ochinol 2in 212carbonsaeureethylester )作催化剂(22氯丙酸∶12萘胺∶EEDQ =1∶1.2∶1,mol/mol ),30℃振荡反应一定时间，直接取样用流动相稀释10倍，或者样品经纯化处理后配成一定浓度进样分析。进样量2μL 。
3 结果与讨论
3.1 衍生化时间对衍生化的影响
在反应液中加入少量苯做内标，不同时间取衍生化反应液样品稀释后直接进样，计算R 型(S 型亦 图1 反应时间对衍生化的影响
Fig .1 Effect of reacti on ti m e on derivatizati on 峰面积比(the peak 2aera rati o of p r oduct and internal stantard benzene )。
可)对映体与苯的峰面积比，结果如图1所示。可以认为3.5h 时反应完全。但10m in 时已反应了约65%,30m in 时反应了约80%，所以,10m in 时即可 图2 未经纯化的22氯丙酸衍生拆分图
Fig .2 Chr omat ogra m of separati on of unpuritied 22chl o 2
r o 2N 212naphthyl p r opana m ide 1.(R )222氯2N 212萘基丙酰胺((R )222chl or o 2N 212naphthyl p r o 2
pana m ide ); 2.(S )222
氯2N 212萘基丙酰胺((S )222chl or o 2N 212naphthyl p r opana m ide ); 3.苯(benzene ); 4.12萘胺(12naphth 2yla m ine )。其它为杂质峰(others are i m purities )。
停止衍生化反应，可较大幅度提高分析效率。3.2 衍生化反应的后续处理步骤
衍生化反应完成后，可直接取样稀释进行分析。尽管样品液中包含少许杂质，但在一般情况下与
22氯2N 212萘基丙酰胺对映体分离较好，不影响纯度分析，例如图2为衍生化反应10m in 时的结果。也
可在衍生化反应停止后将反应液用2mol/L HCl 洗，无水Na 2S O 4干燥，过滤，旋转蒸干后用75%乙醇水溶液在70℃下重结晶两次，得白针状晶体(熔程142～143℃)。再配成一定浓度样品液进样。3.3 温度变化对分离的影响
在V (正己烷)∶V (乙醇)=70∶30体系中，考察了
不同温度对分离因子α的影响，结果如图3所示。从图中可以看出，温度变化对分离因子的影响，呈线性关系。虽然温度越低越有利于两对映体的分离,
但低温操作时，出峰时间长故不适于分析；温度高则不利于谱柱的使命寿命。30℃左右是较适合的分析温度。
3.4 流动相组成对分离的影响
以正已烷为流动相，添加醇类物质调节溶剂极性，考察流动相组成的变化对分离的影响。其中，流速为1.0mL /m in，柱温20℃的数据列于表1。随着流动相极性的降低，分离度和分离因子增大，但流动
相极性小则使出峰时间延长，不适于分析。反之，如
6
911 分析化学第35卷
图3 温度对分离因子的影响
Fig .3 Effect of te mperature on separati on fact or
果较大幅度提高单一醇类溶剂的比例，出
峰时间可以显著缩短，但谱柱承受的压力会越来越大，不利于谱柱的保护。使用甲醇作为极性调节剂，其极性强，用量少，柱压较低，但正己烷与甲醇不互溶。
表1 流动相组成变化对分离的影响
Table 1 Effect of mobile phase constitutes on res oluti on
流动相
Mobile phase
k ′1
k ′2
分离因子α
Separati on fact or 分离度R
Res oluti on
正己烷∶异丙醇
Hexane ∶is op r opanol
90∶107.5929.43 3.914.380∶20 4.2115.27 3.612.770∶30 2.458.48 3.59.4正己烷∶乙醇Hexane ∶ethanol
90∶10 3.8811.93
3.111.080∶20 1.61
4.84 3.08.670∶30 1.27 3.60 2.97.2正己烷∶甲醇∶乙醇Hexane ∶methanol ∶ethanol
90∶5∶5 3.359.95 3.013.280∶15∶5 2.44 6.55 2.712.870∶25∶5 1.98 5.17 2.611.260∶35∶5
1.35
3.46
2.6
9.8
50∶45∶50.88 2.21 2.58.3
鄂尔多斯苏叶女
k ′1,k ′2分别为第一和第二洗提对映体的容量因子(k ′1and k ′2are the
capacity
fact or f or the first 2eluted enanti omer and the second 2eluted enanti omer,
res pectively )。
经过探索发现，加入一定量乙醇，再调节加入甲醇的比例，可以很好地解决这个问题。所以适合分析用的流动相为正己烷2甲醇2乙醇体系。3.5 线性关系、检出限和精密度
22氯2N 212萘基丙酰胺单一对映体的浓度在6.25～200mg/L 范围内，峰面积A 与浓度C (mg/L )呈现良好的线形关系，回归方程为A =164237C +22787,r =1.0000(n =10)。检出限为4μg/L 。连续进样6次进行平行测定，相对标准偏差RS D =2.2%。
3.6 测定(S )222氯丙酸的光学纯度
应用此方法测定作者合成的(S )222氯丙酸的光学纯度。衍生化反应10m in 后直接取样，用流动相
图4 (S )222氯丙酸衍生拆分图
Fig .4 Chr omat ogra m of chiral separati on of (S )222chl or o 2N 212naphthyl p r opana m ide
稀释10倍后进样2μL，如图4所示。两对映体峰面积比1∶93，光学纯度97.9%。用旋光仪和密度仪分别测定了(S )222氯丙酸的旋光度和密度,20℃条件下的测量和计算结果列于表2。
表2 22氯丙酸的旋光测量结果
Table 2 Rotati on test of 22chl or op r op i onic acid
旋光度
Op tical r otati on 密度
Density 比旋光度
Specific r otati on
谱纯
光学纯度(%)
Op tical purity
-17.495
1.2547
-13.94
97.9
3.7 (S )222氯丙酸合成实验优化条件研究
为了考察反应温度对产物22氯丙酸光学纯度的影响,
分别对在4种温度下反应了相同时间的反应液取样进行衍生化处理。取10mL 22氯丙酸的反应液(水为溶剂)，用20mL 二氯甲烷萃取，无水Na 2S O 4干燥15m in，过滤。然后进行衍生化反应10m in，稀释进样。检测结果列于表3。
表3 某(S )222氯丙酸制备过程中温度对产物光学纯度的影响Table 3 Effect of reacti on te mperature on op tical purity of (S )222chl or op r op i onic acid
反应温度(℃)
Temperature
对映体峰面积比
Rati o of the areas of
enanti omers
产物的光学纯度
Op tical purity of p r oduct
(%)
反应温度(℃)
Te mperature
对映体峰面积比
陈中浙Rati o of the areas of
enanti omers
产物的光学纯度
Op tical purity of p r oduct
(%)
552.996.31751.096.230
43.9
95.6
40
41.7
95.3
7
911第8期李俊峰等：柱前衍生化高效液相谱法准确测定22氯丙酸的光学纯度
8911 分析化学第35卷
由表3可见，在合成过程中，反应温度升高使产物22氯丙酸的光学纯度有所降低但影响不大。所以，实际生产中温度控制的范围较大。
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Accura te M ea surem en t of O pti ca l Pur ity of22Chloroprop i on i c Ac i d by Precolu mn D er i va ti za ti on2H i gh Performance L i qu i d
Chroma tography and Its Appli ca ti on
L i Jun2Feng,Du Ting2Ting,Lan Xian2Q iu,Zhang Yi2W en,Song Hang3
(D epart m ent of Phar m aceutical and B iological Engineering,S ichuan U niversity,Chengdu610065)
Abstract 22Chl or op r op i onic acid was p reli m inarily derivatized with12naphthyla m ine at30℃f or10m inutes, and then could be satisfact orily separated in8m in by Chiralcel OD2H column and hexane2alcohol eluent.The effects of compositi on of mobile phase and colu mn te mperature on the chiral separati on were investigated.The op ti m al analysis conditi ons were obtained as:mobile phase,hexane2methanol2ethanol(50∶45∶5,V/V);fl ow rate,1.0mL/m in;te mperature,30℃;wavelength,224n m.More accurate standard s pecific r otati on of 22chl or op r op i onic acid and values are[α]20D213.94(neat,d1.2547)97.9%.This method is p r oved t o be sensitive,easy f or operati on and good for accurate op tical purity measure ment of 22chl or op r op i onic acid.
Keywords 22Chl or op r op i onic acid,p recolu mn derivatizati on,chiral stati onary phase,high perf or mance liquid chr omat ogra mphy,op tical purity
(Received15Nove mber2006;accep ted9May2007)
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