组织中全基因组DNA甲基化的液相谱串级质谱分析
张俊杰,张立坚,刘春安,张良滔,蔡春*
(广东医学院,湛江,524023)
摘要:建立液相谱串联质谱测定组织中全基因组DNA甲基化水平的方法。采用苯酚氯仿提取组织DNA,提取的DNA用88%甲酸在140℃裂解,DNA裂解液加入同位素胞嘧啶作内标,经N2吹干后,用甲醇溶解,以液相谱串联质谱检测胞嘧啶和5-甲基-胞嘧啶含量,并计算全基因组中DNA甲基化的水平。结果表明,胞嘧啶的线性范围为1~100ng/mL,相关系数为0.9974,相对标准偏差为0.70~4.09%;5-甲基胞嘧啶的线性范围为1~50ng/mL,相关系数为0.9948,相对标准偏差为0.60%~4.81%。胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的检出限为1pg,日内相对标准偏差分别为1.86~ 4.67%,日间相对标准偏差为3.72~ 4.68%,胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的加样回收率为86.52%~105.14%。本文建立的方法检测组织中DNA甲基化程度,具有专一性强,操作简便的优点,能较好地满足全基因组DNA甲基化检测的要求。 关键词: DNA甲基化;液相谱质谱联用;胞嘧啶;5-甲基-胞嘧啶
Analysis of Global DNA Methylation in Tissue by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrum
ZHANG Jun-jie,ZHANG Li-jian, LIU Chun-an, ZHANG Liang-tao CAI Chun*
(Guangdong medical college, zhanjiang ,524023)
Abstract:We developed and validate a rapid, sensitive and specific LC/MS/MS method for determination of global DNA methylation in tissue. DNA was extracted by phenol-chloroform, hydrolyzed using 88% formic acid at 140℃, spiked with cytosine-2, 4-13C2,15N2 as internal standard, reconstituted in methanol and analyzed by LC/MS/MS with multiple reaction monitoring mode, to reflect the global DNA methylation level of the tissue. Results show that the limit of quantification was 1ng/mL for both Cytosine (Cyt) and 5-methylcytosine (5mCyt), and the linear range of calibration curve was 1~50 ng/mL and 1~100ng/mL for 5mCyt and Cyt respectively, with correlation coefficient higher than 0.99. The relative standard deviation (RSD) was 0.70~4.09% and 0.60%~4.81% for Cyt a
nd 5mCyt respectively. The intra-day precision expressed as RSD ranged from 1.86% to 4.67%, while the inter-day values from 3.72% to 4.68% .The recovery ratio of method varied from 86.52% to 105.14%. 谱纯This yielded a simple and reliable LC/MS/MS assay for detection of Cyt and 5mCyt, thus enabling the evaluation of global DNA methylation.
Key word: DNA methylation, liquid chromatography-mass spectrum, cytosine, 5-methyl-cytosine
DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分,它是有核细胞特有的复制和转录后修饰,能够在不改变基因组中碱基排序的情况下影响基因转录和表达,它涉及到个体发育,细胞增殖、分化、基因印迹、X染体失活,基因表达调控和碱基突变等多方面的生物学功能[1-4],特别对肿瘤的发生和发展具有重要的生物学意义。肿瘤中DNA甲基化模式发生改变,表现为全基因组低甲基化和某些基因启动子CpG岛区的高甲基化。这种甲基化模式的改变与肿瘤变化的关系,已经成为肿瘤研究的一个热点。 DNA甲基化的准确检测对于研究DNA甲基化变化情况与疾病的关系极为重要。最近有文献报道, DNA经酶解后运用LC/MS/MS技术检测嘧啶核苷的含量,从而计算DNA甲基化程度
的报道[5-7]。此外,也有文献报道DNA通过化学方法裂解后,采用GC/MS扈莹悦方法进行嘧啶含量的检测[8]。本文建立了化学方法将DNA裂解后,运用LC/MS/MS测定嘧啶碱基含量的方法,评价DNA的甲基化程度,并用建立的方法分析了六例结肠癌病人肿瘤组织和正常结肠组织中全基因组DNA甲基化的变化。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
试剂:氯仿,异戊醇, 十二烷基磺酸钠(SDS),无水乙醇,甲酸,乙二胺四乙酸二钠(EDTA)和乙腈 (分析纯级);甲酸胺,甲酸(谱纯级);实验用水为Milli-Q 超纯水;三羟甲基胺基甲烷(Tris)和Tris饱和酚为生化试剂
标准品:胞嘧啶(cytosine, Cyt)和5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mCyt ) 购于Sigma公司,同位素胞嘧啶(cytosine-13C,15N2)购于Toronto research chemicals inc.。
仪器:Sigma 台式高速冷冻离心机3K15(德国sigma公司),UV-2100型紫外可见分光光
度计(上海元析仪器有限公司),液相谱串联质谱(Aglient1200-6430A,美国安捷伦公司)
1.2 储备液和工作液配制
1.2.1储备液配制
准确称取2mg Cyt和5mCyt用甲醇溶解定容50mL,得浓度为40μg/mL Cyt 和5mCyt标准储备液;取2mg 内标物Cyt13C15N用甲醇溶解后,置于50mL容量瓶中定容到刻度,得浓度为40μg/mL Cyt13C15N标准储备液。所有储备液在-20℃冰箱保存待用。
1.2.2工作液配制
临用时取Cyt储备液加甲醇稀释成浓度为100、75、50、40、25、10、7.5、5、2.5和1ng/mL;储备液加甲醇稀释成浓度为50、40、25、10、7.5、5、4、2.5、1和0.5ng/mL工作液;临用时取40μg/mL Cyt13C15N标准储备液加甲醇稀释成浓度为40ng/mL的Cyt13C15N内标工作液。
1.3 样品处理
结肠癌病人手术后取少量肿瘤组织和肿瘤旁正常结肠粘膜组织置-70℃冰箱保存。
1.3.1 DNA提取
取0.05mg组织加入0.12mL蛋白酶K、4mL TE缓冲液和0.48mL 10%SDS,在45℃水浴过夜,加入等体积苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)进行提取,摇匀6000rpm离心5min,取上清,重复提取一次;再加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),摇匀6000rpm离心5min;取上清加入1/10倍体积的3mol/L醋酸钠和2.5倍无水乙醇,12000rpm离心5min,倒去溶液,加入1mL TE缓冲液溶解。用紫外可见分光光度计检测DNA纯度,当A260nm/A280nm=1.7~1.9视为纯DNA。若有RNA污染加入RNase A,然后重复以上步骤。
1.3.2 DNA裂解
取约2.5μg DNA放入反应瓶中,用N2吹干,然后加入0.2mL 88%甲酸在140℃反应90min待其冷却到室温后,用N2吹干,加入400μL甲醇溶解,15000r·min-1,离心4min取上清,待LC/MS分析。
1.4 仪器条件
1.4.1液相谱条件:Aglient 1200型液相谱仪,BEH HILIC谱柱(1.7μm×2.1×100mm, Waters公司);流动相:A为0.1%甲酸铵,B为乙腈。流速:0.4mL/min;柱温为20℃,进样量为5μL;洗脱程序: 0~1min A为10%;1~2min A从10%变为50%;2~2.5min A为50%;2.5~8min A从50%变为10%
1.4.2质谱条件:电喷雾正离子电离模式,离子源温度为300℃;喷雾电压为3.5kV,喷雾气流量9L/min,入口电压为Cyt和 为114V,Cyt13C15服务质量管理N为115V。采用多反应监测模式检测,碰撞能量:Cyt和为20V,Cyt13C15N华县老腔为16V。Cyt 定量离子m/z 112>95,辅助定量离子69, 5mCyt定量离子 m/z 126>109,辅助定量离子 83, Cyt13C15N 定量离子m/z 115>97,辅助定量离子 70。
1.5数据处理
本实验采用内标法定量,以w(5mCyt)/[ w(5mCyt)+ w(Cyt)] ×100%的方式来表示DNA甲基化程度。采用EXCELL进行统计分析。
2 结果
2.1 和Cyt质谱图
分别用1μg/mL Cyt、40ng/mL Cyt13C15N2和1μg/mL 5mCyt标准溶液,进5μL 经MS/MS分析,其质谱图如图1,图中m/z 112([M+H]+),m/z 115([M+H]+)和m/z 126([M+H]+)分别为Cyt、Cyt13C15N和5mCyt分子离子峰;另外从图中可以看出,m/z 112>95和m/z 126>109分别为Cyt和主要的碎片离子,因此选用m/z 112>95和126>109作为Cyt和的定量检测。
A
B
C
图1 Cyt、Cyt13C15N2和5mCyt子离子图
Fig. 1 product ion scan of Cyt (A),Cyt13C15N(B) and 5mCyt(C)
2.3线性范围及精密度实验
混合标准液包括5mCyt和Cyt,其中质量浓度系列为0.5、1、2.5、4、5、7.5、10、25、40和50ng/mL,Cyt质量浓度系列为1、2.5、4、5、7.5、10、25、40、50、75和100ng/mL,加入40ng/mLCyt13C,15N2作内标,分别进样5次。分别以Cyt和5mCyt质量浓度为横坐标,谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,并以信噪比为3确定样品的最低检测限。结果表明,Cyt和5mCyt的检出限为1pg,Cyt的线性范围为1~100ng/mL,标准曲线为y=1.2580x-0.6255,相关系数R2为0.9974,相对标准偏差RSD为0.70~4.09%;的线性范围为1~50ng/mL,标准曲线为y=1216.6212x-593.6998,相关系数R2为0.9948,相对标准偏差RSD为0.60~4.81%。
2.4重现性实验
取同一样品按1.3方法制备3份进行测定Cyt和5mCyt两个谱峰的相对丰度RSD见表1。
表1 结肠癌组织中Cyt和5mCyt重现性
Tab 1. Reproducibility of Cyt and 5mCyt in colon cancer
| Cyt(ng/mL) | (ng/mL) |
1 | 31.4798 | 1.5149 |
2 | 31.8659 | 1.5256 |
3 | 32.2836 | 1.4912 |
RSD% | 1.2611 | 华南钢铁交易网1.1654 |
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2.5 稳定性实验
取同一DNA样品试液,在-20℃保存分别2,4,6,8,10h测定Cyt和5mCyt。以上质谱峰相对丰度的RSD分别为1.86%和4.67%
取同一DNA样品试液,在-20℃保存分别于1,2华夏掠影,3,4,5d测定Cyt和5mCyt。以上质谱峰相对丰度的RSD分别为3.72%%和4.68%。
2.6 回收率实验
取DNA裂解液分别加入Cyt(50、10和1ng/mL)和(50、10和1ng/mL) 400μL加标定量,N2吹干,加入400μL甲醇溶解,15000r·min-1离心5min,取上清液用于LC/MS分析,测定Cyt回收率分别为87.38%、105.14%和96.18%;5mCyt回收率分别为89.58%、86.52%和94.52%。