第5卷 第1期 食品安全质量检测学报 Vol. 5 No. 1
2014年1月
Journal of Food Safety and Quality
Jan. , 2014
*通讯作者: 任一平, 教授级高级工程师, 主要研究方向为卫生理化检验技术及食品安全检测技术。E-mail: renyiping@263
*Corresponding author: REN Yi-Ping, Professor Senior Engineer, Zhejiang Provincial Center for Disease Prevention and Control, No.3399, Bingsheng Road, Binjiang District, Hangzhou310051, China. E-mail: renyiping@263
高压液相谱法同时测定婴幼儿配方乳粉中的叶
河南省农业经济学校
郑菲菲1, 陶保华1, 赖世云1, 黄百芬2, 任一平2*
(1. 浙江贝因美科工贸股份有限公司, 杭州 310057; 2. 浙江省疾病预防控制中心, 杭州 310051)
摘 要: 目的 建立同时测定婴幼儿配方乳粉中叶黄素和β-胡萝卜素的快速测定方法。方法 奶粉样品加 2 mL 50%氢氧化钾碱溶液, 在70 ℃水浴下皂化15min, 经石油醚：乙醚(1:1,v/v )提取, 水洗、浓缩后, C 30谱柱分离, 在450 nm 波长处检测, 外标法定量。结果 叶黄素和β-胡萝卜素在0.2~4.0 μg/mL 范围内线性良好, 相关系数: R 2>0.9990; 三浓度水平加标回收率均在80%~90%之间, 样品及三个浓度水平加标6次重复试验RSD 均<5%。结论 该方法准确、简单、快速且能同时测定婴儿配方乳粉中的叶黄素和β-胡萝卜素含量。 关键词: 高压液相谱法; 婴儿配方奶粉; 叶黄素; β-胡萝卜素 Simultaneous determination of lutein and β-carotene in infant formulas by
high pressure liquid chromatography
ZHENG Fei-Fei 1, TAO Bao-Hua 1, LAI Shi-Yun 1, HUANG Bai-Fen 2, REN Yi-Ping 2*
(1. Zhejiang Beingmate Research Institute , Hangzhou 310057, China ;
2. Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention , Hangzhou 310051, China )
丰子恺画画不要脸ABSTRACT: Objective To establish a rapid method for simultaneous determination of lutein and β-caortene
in infant formulas by high pressure liquid chromatographic. Methods The homogenized samples were added with 2 mL 50% potassium hydroxide solution, saponified at 70 ℃ for 15 min then extracted with petroleum ether and diethyl ether followed by wash and concentration. The lutein and β-carotene were separated by an C 30 column and detected by the UV detector at a wavelength of 450 nm. Results The method showed a good li-nearity over the range of 0.2~4.0 μg/mL with R 2>0.9990. The recoveries at three spiked levels were between 80%~90%. The relative standard deviation was less than 5%. Conclusion This method is simple, rapid and ac-curate for simultaneous determination of lutein and β-carotene in infant formulas.
KEY WORDS: high pressure liquid chromatography ; infant formulas; lutein; β-carotene
1 引 言
叶黄素(lutein)化学名称: 3’3 -二羟基-α-胡萝卜素, 分子式: C 40H 56O 2, 相对分子量: 568.85。叶黄素不溶于水, 易溶于油脂和有机溶剂。纯的叶黄素为棱
格状黄晶体, 有金属光泽, 对光和氢不稳定, 需贮
存于阴凉干燥处, 避光密封[1]。叶黄素是眼睛黄斑和晶状体中唯一被发现的类胡萝卜素, 是国际公认的具有独特生理功能的天然活性物质, 有助于降低、延缓眼睛的老化、退化和病变, 并能有效地减少眼疾的
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食品安全质量检测学报 第5卷
发生, 能有效地保护视网膜免受光线的伤害, 促进宝宝视力的发育, 与婴幼儿的学习和记忆能力也密切相关。研究发现, 眼睛缺乏叶黄素和维生素, 极易导致多种眼部疾病和眼睛发育不良[2]。
β-胡萝卜素(β-carotene), 其分子式为 C 40H 56, 为紫红或暗红的结晶性粉末, 不溶于水, 微溶于乙醇和乙醚, 易溶于氯仿苯和油, 熔点为176～180 ℃。胡萝卜素分为α-, β, γ-三种异构体, 其中β-胡萝卜素比较稳定, 效力也最强[3]。β-胡萝卜素的化学性质不稳定, 易在光照和加热时发生氧化分解, 储存过程中应避免直接光照、加热和空气接触, 应低温贮存在不活泼的气体(如N 2)中, 其操作也应在黄光下进行。β-胡萝卜素在动物体内可转变为维生素A, 是人体必需的微量营养成分, 它既可提高人体免疫力, 又是一种抗氧化剂, 可清除机体产生的自由基[4,5]。
人体自身无法合成叶黄素和β-胡萝卜素, 新生婴幼儿只能从母乳或配方奶粉中摄取以满足生长发育的需
要。我国食品营养添加剂使用标准中, 叶黄素和β-胡萝卜素都被列为营养强化剂。市场上许多婴幼儿食品企业都将叶黄素和β-胡萝卜素作为自身品牌的亮点, 添加到婴幼儿配方奶粉中。因此, 建立同时测定婴幼儿配方奶粉中叶黄素和β-胡萝卜素的快速测定方法, 对婴幼儿配方奶粉和产品的质量监控具有十分重要的意义。
虹膜识别系统
目前, 国内外有关于叶黄素和β-胡萝卜素的检测方法
谱纯[2-16]
主要有纸层析法、薄层层析、柱层析、分
光光度法、高压液相谱法和液质联用法。纸层析法、薄层层析、柱层析、分光光度法操作简单但无法将叶黄素和β-胡萝卜素分离和准确定量; 液质联用法需要相应的同位素内标才能实现准确定量, 但目前市场上无法买到; 高压液相谱法
[6-17]
可实现对待测物
中叶黄素和β-胡萝卜素分离和定量分析。ODS C 30固定相具有较高的分离效果, 能将不同活性的叶黄素和β-胡萝卜素顺反异构体分离[18]; 单一波长的检测
器具有高选择性和灵敏度, 分析检测速度快等优点, 使高压液相谱法在类胡萝卜素的分析与检测中得到最为广泛的应用。
由于叶黄素和β-胡萝卜素性质不稳定, 实际样品中添加的叶黄素和β-胡萝卜素原料都是经微胶囊化处理的, 直接用有机溶剂提取破囊困难, 提取效率差 [11]。因此, 样品前处理方法优化是本文的重点。文献[11]报道叶黄素最低检测限为3.2 μg/100 g, β-胡萝卜素最低检测限为0.8 μg/100 g 。考虑两者都具有较高的灵敏度, 本实验以“GB 5413.35-2010 婴幼儿食品和乳品中β-胡萝卜素的测定” [12]和文献[11-22]中的皂化法测定叶黄素和β-胡萝卜素为基础, 将样品的称样量缩小5~10倍并相应的减少提取溶剂的用量, 使前处理可以在50 mL 的离心管中进行。对样品前处理条件过程中的影响皂化的关键因素(皂化时间、温度、加碱量)和谱分离条件进行优化, 建立能简单、快速、准确测定婴幼儿配方奶粉中叶黄素和β-胡萝卜素的高灵敏度方法, 为今后新国标的修订、为相关企业的质量控制水平的提高提供参考。 2 材料与方法
2.1 材料与试剂
2.1.1 试 剂
叶黄素(纯度: ≥98%, 浙江医药股份有限公司新昌制药厂提供); β-胡萝卜素(纯度: ≥97%, 美国Fluka); 甲醇、乙醇、甲基叔丁基醚(Merk 谱纯), 四氢呋喃(Sigma, ≥
99%), 石油醚(
计委大院北京化工厂, 分析纯), 乙醚(杭州化学试剂有限公司, 分析纯), 乙醇(安徽安特食品股份有限公司, 分析纯), 氢氧化钾(杭州萧山化学试剂厂, 分析纯), 抗坏血酸(广东光华科技股份有限公司, 分析纯), 无水硫酸钠(温州市化学用料厂, 分析纯, 将硫酸钠的放于400 ℃马弗炉灼烧4 h, 冷却后待用), 2,6-二叔丁基对甲苯酚(上海凌峰化学试剂有限公司, 分析纯); 实验用水为超纯水。
图1 叶黄素、β-胡萝卜素结构图征引
Fig. 1 The structures of lutein and β-carotene
第1期
郑菲菲, 等: 高压液相谱法同时测定婴幼儿配方乳粉中的叶黄素和β-胡萝卜素 229
2.1.2 仪器与设备
Ultimate-3000RS 高压液相谱仪, 配二极管阵列检测器(美国DIONEX 公司); Allegra 64R 型离心机(美国Beckman Coulter 公司); 50 mL PP 材料离心管(美国Labcon 公司); N-EVAP112氮吹仪(美国Organomation Associates 公司); 谱柱: YMC Caro-tenoid 谱柱(4.6 mm×250 mm 粒径3 μm)(日本YMC 公司); Milli-Q 水纯化系统(美国Millipore 公司); UV2600型紫外-可见光分光光度计(上海天美科学仪器有限公司); QL-861型涡旋混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司); SHA-B 型水浴恒温振荡锅器(金坛市国旺仪器); BSA224S-CW 型电子天平(德国Sartorius 公司)。
2.2 样品前处理
2.2.1 皂化: 称取均匀的固体试样1 g(精确到0.001 g)于50 mL 离心管中, 加5 mL 超纯水涡旋溶解。在试样溶液中加入0.5 g 抗坏血酸、10 mL 含0.1% BHT 的乙醇溶液、2 mL 50% 氢氧化钾水溶液, 盖紧盖子涡旋混匀后, 置于70 ±1 ℃℃水浴恒温振荡器中避光皂化15 min , 取出后迅速置于冰浴中冷却至室温。 2.2.2 提取: 在经皂化后的试样离心管中加入20 mL 石油醚：乙醚(1:1, v/v )混合溶液, 充分涡旋提取90 s 后, 在7000 r/min 下离心1 min 使分层。将有机相转入另一50 mL 离心管中, 加入20 mL 超纯水水洗, 水洗2次, 轻微摇晃后, 在7000 r/min 下离心1 min 使分层。将有机相转入25 mL 锥底玻璃试管(如水相也被取出, 可加入0.5 g 无水硫酸钠脱水), 置于40 ±2 ℃℃充氮条件下吹干。准确加入2.0 mL 甲醇：甲基叔丁基醚(1:1, v/v )复溶, 涡旋混匀后用0.22 μm 微孔滤膜过滤至2 mL 棕进样瓶中, 待测(10℃保存)。
2.3 标准溶液配制及校准
2.3.1 标准储备液配制: 分别称取叶黄素、β-胡萝卜素标准品10 mg, 用含0.1% BHT 的四氢呋喃溶液溶解, 定容至25 mL, 得400 μg/mL 标准储备液。用甲醇：甲基叔丁基醚(1:1, v/v )分别稀释得到浓度
为20 μg/mL 中间储备液。用甲醇：甲基叔丁基醚(1:1, v/v )溶液稀释得到20 μg/mL 混标, 置于-20 ℃下暗处保存。
2.3.2 标准溶液浓度校准: 分别取叶黄素、β-胡萝卜素中间储备液各1 mL 于两个10 mL 容量瓶中, 分别用无水乙醇(谱纯)定容至10 mL 。乙醇(谱纯)作为空白, 用分光光度计, 在各自的校准波长下测定吸光值A , 根据比吸光系数计算溶液的实际浓度X (波长及吸光系数见表1)计算公式如下: 41%
110cm
A
X E =
×
2.3.3 标准溶液纯度校准: 研究表明, 叶黄素的顺反异构体在稳定性和生理功能等方面存在着明显的差异[22]。叶黄素和β-胡萝卜素遇光、氧、热极不稳定且顺式异构体和降解生成的物质在校准波长下也有吸收。为能准确定量, 实验将叶黄素、β-胡萝卜素单标分别按照2.4检测参考条件进样, 通过C 30谱柱将降解物和其自身的顺式异构体分离, 通过峰面积之比, 得到标准品的纯度系数。将校准后标准品的浓度乘以标准品的纯度系数, 得到标准品的实际浓度。
2.4 分离检测参考条件
谱柱: YMC Carotenoid C 30(4.6 mm×250 mm, 粒径3 μm); 柱温: 30 ℃; 进样体积: 20 μL; 进样盘温度: 10 ℃; 检测波长: 450 nm; 流动相: A: 甲醇 B: 叔丁基甲醚; 梯度洗脱条件: 0 ~1 min A% 100%, 1
~2 min A% 100%~93%, 2 ~3 min A% 93%~85%, 3 ~6
min A% 85%~75%, 6 ~10 min A% 75%~60%, 10 ~14 min A% 60%~20%, 14 ~16 min A% 保持20%, 16 ~17 min A% 20~100%, 17~25 min A% 保持100%; 流速1 mL/min; 总运行时间为25 min 。
3 结 果
3.1 谱条件优化
3.1.1 谱柱的选择
Carotenoids(C 30)谱柱是为分离类胡萝卜素异构体所设计的谱柱, 能在相同的流动相的条件下,
表1 标准品吸光值及测定条件
Table 1 Absorption and determination conditions of standards
标准品 比吸光系数%
11cm
E 波长λ (nm)标准品
比吸光系数%
11cm
E 波长 λ (nm)
叶黄素 (lutein)
2550 445 β-胡萝卜素(β-carotene) 2620 450
230
食品安全质量检测学报 第5卷
将β-胡萝卜素的顺式和反式异构体和叶黄素中的极性叶黄素异构体及玉米黄质进行分离, 可分离血液样品、食品、天然产品提取物中的胡萝卜素[18-22]。用于类胡萝卜素HPLC 分离检测的谱柱固定相主要有正相硅胶、C 18及C 30等[11-22], 其中, 正相硅胶柱不能从其他类胡萝卜素中彻底分离叶黄素, 反相C 18谱柱在类胡萝卜素的谱分离中应用广泛, 但不能分离类胡萝卜素各自相应的顺式异构体。
为选择合适的分析柱, 实验取叶黄素和β-胡萝卜素混标, 分别用四根不同品牌和规格的C 30谱在各自适宜的流动相条件下检测分离, 结果见图2。
由图2可知, 柱1: 叶黄素峰宽有1 min, β-胡萝卜素峰前沿, 峰形差; 柱2、3: 叶黄素峰后延, 与顺式叶黄素无法分离, β-胡萝卜素峰形较好; 柱4: 对叶黄素, β-胡萝卜素都有较强保留, 能实现与顺式叶黄素分离且峰型较好。综上所述, 实验选择柱4作为分析柱。
3.1.2 流动相的选择优化
“GB5413.35—2010婴幼儿食品和乳品中β-胡萝卜素的测定” [12]中流动相为：乙腈：甲醇
(3:12:85)等度洗脱; “GB/T 23209-2008 奶粉中叶黄素的测定” [7]以甲醇：甲基叔丁基醚(85:15)作为初始流动相, 后面逐步增大甲基叔丁基醚用量, 梯度洗脱。两种条件都无法用于同时测定叶黄素和β-胡萝卜素。实验以100%甲醇作为初始流动相, 后面加入甲基叔丁基醚梯度洗脱叶黄素和β-胡萝卜素(详细梯度洗脱条件见步骤2.4), 使叶黄素和β-胡萝卜素样品能完全
与杂志和异构体分离, 结果见图3。
3.1.3 定容液和进样体积的确定
甲醇、甲醇：甲基叔丁基醚(1:1, v/v )、甲基叔丁基醚分别作为定溶液溶解按照步骤2.2处理好的样品。结果显示, β-胡萝卜素在甲醇里的溶解度较差无法完全溶解样品, 导致结果偏低; 甲基叔丁基醚作为定溶液溶解效果好, 但进样后溶剂效应大导致峰型变差。以甲醇：甲基叔丁基醚(1:1, v/v )作为定容液能完全溶解样品, 进样体积小于等于20 μL 时峰形较好, 但进样体积大于20 μL 也会出现溶剂效应。综合考虑, 实验选择甲醇：甲基叔丁基醚(1:1, v/v )作为定溶液, 进样体积为20 μL 。
3.2 皂化条件的优化
3.2.1 皂化时间和温度的优化
尽管碱皂化法在乳制品中脂溶性维生素的检测上已有大量的应用。但是由于类胡萝卜素在碱性和
高温条件下容易破坏, 所以有必要选择较为温和的皂化条件, 有效水解样品中的甘油三酯, 释放类胡萝卜素。
实验称取1 g 奶粉样品于50 mL 离心管中, 加5
mL 超纯水溶解后, 加入0.5 g 抗坏血酸, 10 mL 含0.1% BHT 的乙醇溶液, 2 mL 50% 氢氧化钾水溶液。盖紧盖子涡旋混匀后, 分别置于50、60、70和80 ℃水浴恒温振荡器中, 研究皂化10、15、20、30、40 min 对样品中叶黄素和β-胡萝卜素释放量的影响, 结果见图4。
图2 不同规格的谱C 30柱分离度比较
Fig. 2 Comparison of resolution with different specifications of C 30 column
注: 1号峰为叶黄素素, 2号峰为β-胡萝卜素, 3号峰为顺式叶黄素
第1期郑菲菲, 等: 高压液相谱法同时测定婴幼儿配方乳粉中的叶黄素和β-胡萝卜素 231
图3 标准图和样品图
Fig. 3 Chromatogram of standard and sample
图4 皂化条件对叶黄素和β-胡萝卜素释放量的影响(n=3)
Fig. 4 Effect of saponification conditions on amount of lutein and β-carotene (n=3)
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