㊃基础研究㊃
基金项目：国家自然科学基金(81573917,81973832)
作者单位:100053 北京，中国中医科学院广安门医院消化内科[姜心航(硕士研究生)㊁刘绍能㊁马继征㊁丁佳媛㊁刘慧敏]，病理科(张玲㊁路迎冬)；新疆维吾尔自治区人民医院中医科(张荣)
作者简介：姜心航(1993-),2020级在读硕士研究生㊂研究方向：脾胃病的中医药防治研究㊂E⁃mail:623128626@qq
通信作者：刘绍能(1962-)，博士，博士生导师，主任医师㊂研究方向：脾胃病的中医药防治研究㊂E⁃mail:
liushaoneng@126
姜心航 张荣 刘绍能 马继征 丁佳媛 刘慧敏 张玲 路迎冬
【摘要】 目的 探讨芪术颗粒含药血清对四氯化碳(CCl 4)诱导的肝纤维化模型大鼠肝窦内皮
细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)失窗孔化及整合素αVβ3(integrin αVβ3,ITGαVβ3)-黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)⁃大鼠肉瘤(rat sarcoma,Ras)/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen⁃悲哀的玩具阅读答案
activated protein kinases,MAPK)信号通路的影响与机制㊂方法 70只雄性Wistar 大鼠，先取50只
大鼠分为正常对照组㊁模型组及芪术颗粒高㊁中㊁低剂量组，每组10只，分别给予相应处理，制备含药血清和正常对照组血清㊂另20只雄性Wistar 大鼠用于制备肝窦内皮细胞，其中14只大鼠采用CCl 4
腹腔注射建立肝纤维化模型4周后，采用Masson 与HE 染观察肝纤维化程度㊂另6只大鼠作为正常对照㊂分离LSECs，将LSECs 分为阳性对照组㊁模型组㊁芪术低剂量组㊁芪术中剂量组㊁芪术高剂量组，其中模型组加入正常大鼠血清，其余组分别加入相应含药血清，常规培养48小时，进行相关指标检测㊂流式细胞仪检测大鼠肝窦内皮细胞中的血小板-内皮细胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule⁃1,CD31)阳性细胞比例和肝窦内皮细胞1抗体(hepatic sinusoidal endothelial cells antibody,SE⁃1)阳性细胞比例；扫描电镜观察肝窦内皮细胞窗口情况;Western Blot 法检测LSECs 中
CD31㊁SE⁃1㊁Ras㊁ITGαVβ3㊁FAK㊁MAPK㊁磷酸化黏着斑激酶(phosphorylation focal adhesion kinase,p⁃FAK)及磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(phosphorylation mitogen⁃activated protein kinases,p⁃MAPK)蛋
白表达情况㊂结果 (1)大鼠CCl 4腹腔注射造模后纤维增生显著，肝纤维化LSECs 组的CD31阳性
细胞比例和SE⁃1阳性细胞比例均显著升高㊂(2)模型组窗孔数少而稀疏，芪术颗粒干预后，扫描电镜观察LSECs 窗孔数有所恢复，尤以芪术高剂量组明显㊂(3)与模型组比较，芪术各剂量组的SE⁃1㊁CD31㊁αVβ3表达量明显降低(P <0.05)，其中芪术各剂量组的SE⁃1㊁CD31㊁αVβ3表达量随剂量的升高而降低，表现为一定的剂量依赖关系㊂与正常对照组相比，模型组LSECs 中整合素αⅤβ3㊁p⁃FAK 和p⁃MAPK 蛋白的表达增加(P <0.05)㊂(4)经芪术颗粒含药血清后,CCl 4诱导的肝纤维化大鼠LSECs 整合素αⅤβ3㊁FAK㊁MAPK㊁p⁃FAK 和p⁃MAPK 蛋白表达降低(P <0.05)㊂结论 芪术颗粒含药血清可通过减轻CCl 4诱导的肝纤维化大鼠LSECc 失窗孔化㊁改变LSECs 表型，减少毛细血管的增值，从而发挥抗肝纤维化的作用，其机制可能与调控整合素αVβ3⁃FAK⁃Ras /MAPK 信号通路有关㊂
【关键词】 肝纤维化; 肝窦内皮细胞; 芪术颗粒; 窗孔; 动物实验; 细胞实验; 信号通路; 大鼠
【中图分类号】 R285.5 【文献标识码】 A doi:10.3969/j.issn.1674⁃1749.2022.08.008Effect of Qizhu Granule on hepatic sinusoidal endothelial cells and its mechanism
JIANG Xinhang ,ZHANG Rong ,LIU Shaoneng ,MA Jizheng ,DING Jiayuan ,LIU Huimin ,ZHANG Ling ,
LU Yingdong
Guang'anmen Hospital,Chinese Academy of traditional Chinese Medicine,Beijing100053 Corresponding author:LIU Shaoneng,E⁃mail:liushaoneng@sohu
农村文化建设论文【Abstract】 Objective To investigate the effects of Qizhu granule containing serum on fenestration and integrin of hepatic sinusoidal endothelial cells(LSECs)in carbon tetrachloride(CCl4)⁃induced hepatic fibrosis model ratsαVβ3⁃FAK Ras/MAPK signaling pathway.Methods 70male Wistar were prepared for this experientment.50rats were divided into the normal control group,the model group and the Qizhu granule high,medium and low dose groups,with10rats in each group.They were treated respectively to prepare drug containing serum and the normal control group serum.The other20rats were used to prepare hepatic sinusoidal endothelial cells.Among them,14rats were injected intraperitoneally with CCl4to establish hepatic fibrosis model.After4weeks,the degree of hepatic fibrosis was observed by the methods of Masson and HE staining.The other6rats were used as the normal control.Lsecs were separated and divided into the positive control group,model group,low dose group,medium dose group and high dose group.The model group was added with normal rat serum,and the other groups were added with corresponding drug containing serum.After48hours of routine culture,the relevant indexes were detected.The proportion of platelet endothelial cell adhesion molecule⁃1(CD31)positive cells andhep
atic sinusoidal endothelial cells antibody(SE⁃1)positive cells in rat hepatic sinusoidal endothelial cells were detected by flow cytometry,the window of hepatic sinusoidal endothelial cells was observed by scanning electron microscope,and CD31,SE⁃1,rat sarcoma(Ras)and integrinαVβ3,(ITGαVβ3).Expression offocal adhesion kinase(FAK),mitogen⁃activated protein kinases(MAPK),phosphorylation focal adhesion kinase(p⁃FAK)andphosphorylation mitogen⁃activated protein kinases(p⁃MAPK)protein.Results (1) After intraperitoneal injection of CCl4in rats,fibrogenesis was improved.The proportion of CD31positive cells and SE⁃1positive cells in the hepatic fibrosis lsecs group was increased significantly.2.The number of fenestras in the model group was small and sparse.After the intervention of Qizhu granule,the number of fenestras in lsecs recovered by scanning electron microscope,especially in the high⁃dose group.3. Compared with the model group,SE⁃1,CD31αVβ3The expression of SE⁃1,CD31and CD31in Qizhu granule group were significantly decreased(P<0.05).Compared with the normal control group,the expression of p⁃Fak and p⁃MAPK was increased(P<0.05).4.Integrin of lsecs in rats with liver fibrosis induced by CCl4after treatment with Qizhu granule medicated serumαⅤβ3.The expression of FAK, MAPK,p⁃Fak and p⁃MAPK was decreased(P<0.05)㊂Conclusion Qizhu granule containing serum can play an anti hepatic fibrosis role by reducing the loss of window porosity of LSECs,changing the phenotype of LSECs and reducing the increment of capillaries in CCl4induced hepatic fibrosis rats,and its mechanism may be related to the regulation of integrinαⅤβ3⁃FAK⁃Ras/MAPK signal pathway.
【Key words】 Hepatic fibrosis; Sinusoidal endothelial cells; Qizhu granule; Window hole; Animal experiments; Cell experiment; Signal path; Rat
肝窦毛细血管化是肝纤维化和肝硬化的基本病理改变，一方面导致肝细胞与血液物质交换障碍，另一方面促进细胞外基质(extracellular matrix, ECM)大量沉积，加重肝纤维化[1]㊂因此，抑制肝窦毛细血管化的发生，对延缓肝纤维化发展有重要意义㊂芪术颗粒由黄芪㊁白术㊁柴胡㊁茵陈㊁丹参㊁莪术等药组成，具有益气健脾㊁化瘀通络㊁利湿解毒之功效，是我院肝纤维化的有效药物，临床应用已有30余年㊂以往实验研究证实，该药对肝纤维化模型大鼠有良好的防治效果[2⁃3]㊂本研究建立肝纤维化模型基础上分离肝窦内皮细胞，结合电子显微镜技术，从细胞㊁分子水平上观察芪术颗粒对肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)窗孔㊁表型及其毛细血管化的影响及机制，以进一步阐明该药抗纤维化的作用机制㊂
1 材料与方法
1.1 实验动物
70只雄性Wistar大鼠，体质量180~200g，清洁Ⅱ级，由军事医学科学院(中国北京)实验动物中心提供㊂这些大鼠被关在笼中，在环境控制室内(20±2℃，相对湿度36%)进行12小时的光/暗循
环，允许自由获取食物和水，用标准合成饲料喂养，所有研究方案均经中国中医科学院广安门医院动物伦理委员会批准，伦理委员会受理编号为:
IACUC⁃GAMH⁃2020⁃003㊂
1.2 药物
芪术颗粒(文件号：京药制字Z20063189)由中国中医药研究院广安门医院制剂室(中国北京)制备并提供，曾被列为国家 九㊃五”攻关项目(项目编号96⁃906⁃08⁃03)，后又列为国家”十㊃五”攻关项目(项目编号2001BA701A⁃24)㊂芪术颗粒组成：黄芪15g㊁莪术9g㊁白术15g㊁丹参15g㊁桃仁10g㊁茵陈15g㊁郁金10g㊁柴胡10g㊁北豆根10g㊁甘草6g，临床用量为每次6g，每日2次，每日总剂量12g㊂动物和人类每千克体重的剂量换算系数为6.25(参考史新友编辑的‘现代医学实验动物学“)，大鼠的剂量为1.25g/(Kg㊃d)㊂
1.3 试剂
四氯化碳(CCl4)：分析纯，北京化学试剂公司㊂CCl4(阿拉丁生物,C112041⁃500mL)；橄榄油(分析纯，北京化学试剂公司)㊂整合素αVβ3(integrin αVβ3,ITGαVβ3)(Abcam,ab52939)；台盼蓝染试剂盒(Beyotime,C0011)；肝窦内皮细胞1抗体(hepatic sinusoidal endothelial cells antibody,SE⁃1)试剂(NOV
US,NB110⁃68095SS)；血小板 内皮细胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule⁃1, CD31)试剂(Affinity,AF6191)；无水乙醇㊁二甲苯㊁盐酸㊁氨水㊁中性胶(国药集团化学试剂有限公司，中国)㊁Masson染试剂盒(Solaibao,G1340⁃7，中国北京)㊁甲苯氨蓝染溶液(谷歌生物科技,G1032，中国武汉)㊂
1.4 主要仪器
病理切片机(徕卡仪器有限公司,RM2016，中国上海)，立式光学显微镜(奥林巴斯,IX71)，台式低速离心机[中国上海医疗设备厂医疗设备有限公司(80⁃2)]㊁振荡器[中国上海西部分析仪器厂(WH⁃2)]㊁电泳仪(泰农,EPS300)㊁酶标准仪(赛默, muLISKANMK3)㊁4℃离心机(Eppendorf，离心机5415R)㊁扫描电子显微镜(日立,SU8010)㊁FACS流式细胞仪(美国BD公司C6)㊂
1.5 实验方法
1.5.1 制备药物血清 雄性Wistar大鼠50只，分为芪术颗粒高㊁中㊁低三个剂量组及模型组㊁正常组，每组10只㊂芪术颗粒按1.25g/(Kg㊃d)为中剂量组，中剂量的2倍剂量为高剂量组,0.5倍剂量为低剂量组；模型组与正常组与三蒸水灌胃㊂均每天灌胃2次，连续5次灌胃，末次灌胃后1小时于超净台中自心脏采血，收集的血液在4℃冰箱垂直静置3小时，在4℃离心机中离心3000rpm×30分钟，离心后于超净台中无菌条件下分离出血清并于
百变神龙56℃水浴箱灭活血清30分钟，灭活后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌㊂
1.5.2 大鼠肝纤维化模型构建 雄性Wistar大鼠20只，大鼠适应性喂养1周后，随机取14只造模，大鼠以3mL/Kg体重腹腔注射40%四氯化碳(橄榄油稀释)造模，每周2次，连续4周，建立肝纤维化模型㊂另6只大鼠作为正常组，同等条件下饲养，不造模㊂各组均每周称体重1次，依体重调整给药剂量㊂4周后处死大鼠，各组肝组织进行HE和Masson染，观察肝组织损伤和肝纤维化情况㊂对照组肝小叶结构正常，肝细胞胞浆保存完好，细胞核清晰㊂CCl4诱导4周后，肝小叶细胞出现典型的脂肪变性㊁门脉和小叶炎症，即小叶细胞内有脂肪空泡㊁炎性细胞浸润㊁肝小叶内有肝小叶细胞浸润㊁肝小叶内有肝小叶细胞浸润，小叶中央区域的细胞肿胀和脂质变性㊂Masson染显示正常大鼠无纤维增生，而模型组有纤维组织增生及纤维间隔形成，提示成功建立了肝纤维化动物模型㊂
1.5.3 原位分离大鼠肝窦内皮细胞 成功制作肝纤维化大鼠后，将大鼠麻醉致死，将30G无菌针头插入门静脉，切断下腔静脉㊂以5mL/min的速度注射含有0.5mm EDTA且不含Ca2+或Mg2+的HBSS10分钟㊂然后以5mL/min的速率用胶原酶和含有0.02%IV型的Ca2+和Mg2+HBSS注释10分钟㊂灌注结束时，小心地取出肝脏并转移到含有5%血清的DMEM中，用无菌镊子撕开肝包膜，使肝实质和非实质细胞流出㊂收集的细胞悬浮液以50×g的低速离心10分钟，收集上清液，沉淀以400×g的速度离心10分钟，沉淀用完整的DMEM 培养基重新悬浮，并小心地添加到含有50%percoll 和25%percoll的离心管中㊂以900×g的高速离心20分钟(无刹车)后，在25%percoll和50%percoll 之间观察到明显的非必需细胞
带㊂DMEM培养基重完全悬浮后仔细吸出，离心冲洗掉percoll液残留，加入非实质细胞悬浮液24孔板,20分钟后置于细胞培养中，不黏壁细胞悬浮后含1%离心性血内皮生长因子而5%的内皮ECM按2×106/mL悬
浮接种后在鼠尾胶原包装中为6孔或96孔板㊂细胞在37℃和5%CO2下培养㊂
1.6 检测内容和方法
1.6.1 分组与处理 正常组：不造模LSECs，加正常不含药血清；模型组：造模LSECs，加正常不含药血清；低剂量组：造模LSECs，加中药低剂量药物血清；中剂量组：造模LSECs，加中药中剂量药物血清；高剂量组：造模LESCs，加中药高剂量药物血清；血清添加量为10%，于37℃㊁5%CO2的培养箱中培养，贴壁后换液，培养48小时后进行相关指标检测㊂1.6.2 流式细胞术 当细胞生长到覆盖培养瓶80%或以上时，丢弃培养液并用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)清洗细胞一次㊂用0.25%胰蛋白酶消化，加入抗兔CD31和抗鼠SE⁃1, 4℃孵育过夜，离心,PBS冲洗，加入二抗，流式细胞仪检测PE⁃CD31和FITC⁃SE⁃1的表达率㊂实验重复三次㊂
1.6.3 扫描电镜观察LSECs窗孔 贴壁于盖玻片的细胞培养处理完成后弃培养基，用PBS轻轻漂洗后，弃PBS加电镜固定液室温固定2小时，再转移至4°保存㊂锇酸后固定，梯度脱水，临界点干燥，将样本紧贴于导电碳膜双面胶上，在离子溅射仪样品台上进行喷金30秒左右，扫描电子显微镜下观察LSitg
ECs窗孔㊂
1.6.4 Western Blot检测 CD31㊁SE⁃1㊁大鼠肉瘤(rat sarcoma,Ras)㊁ITGαVβ3㊁黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)㊁丝裂原活化蛋白激酶(mitogen⁃activated protein kinases,MAPK)㊁磷酸化黏着斑激酶(phosphorylation focal adhesion kinase,p⁃FAK)及MAPK的蛋白表达，收集的细胞用含有蛋白酶抑制剂的裂解液(完整，罗氏)(50mM的Tris⁃Cl,pH7.4,1mM的EDTA pH8.0,250mM的NaCl 和1%Triton⁃X)裂解㊂使用BCA法(Beyotime P0011)测量蛋白质裂解物浓度㊂将10μg细胞裂解液与5倍样品缓冲液(15g的SDS㊁16.6mL的b⁃巯基乙醇㊁15.6mL2MTris pH6.8㊁57.5g甘油)混合后，将样品装入10%聚丙烯酰胺凝胶中,SDS⁃PAGE 分离并转移至PVDF膜㊂用含有0.1%Tween的4%牛奶封闭后，添加以下抗体并在4℃下培养过夜:SE⁃1抗体㊁CD31抗体㊁ɑβ3抗体㊁FAK抗体㊁p⁃FAK抗体㊁MAPK抗体㊁p⁃MAP抗体㊁GAPDH抗体㊂用含有0.1%Tween的PBS溶液清洗膜3次后，添加含有0.1%吐温和HRP二级抗体(Abcam,ab6721)的4%牛奶，并在室温下培养2小时㊂取下膜，将ECL显影液(Bio⁃Rad no.170⁃5060)逐滴添加到膜中，并将其放入GelDoc成像系统(Bio⁃Rad)中拍照㊂蛋白表达水平用内部参考蛋白GAPDH标准化㊂ImageJ v1.8.0软件进行灰度分析㊂实验重复三次㊂1.7 统计分析
统计分析采用spss18.0软件㊂计量资料符合正态分布，方差齐，采用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂
2 结果
2.1 流式细胞仪检测CD31和SE⁃1的表达率
观察CD31与SE⁃1的表达㊂流式细胞术对各组大鼠肝窦内皮细胞的CD31阳性细胞比例和SE⁃1阳性细胞比例进行了检测，从结果可以看出，对照组和肝纤维化组LSECs的CD31㊁SE⁃1阳性细胞比例均在90%以上㊂与对照组相比，肝纤维化LSECs 组的CD31阳性细胞比例和SE⁃1阳性细胞比例均显著升高(P<0.05)(见图1㊁表
1)㊂
图1 流式细胞术鉴定LSEC
表1 各组细胞流式细胞术检测CD31与
SE-1表达结果(x±s,%)
组别n CD31SE-1
对照组393.96±0.4093.70±0.36
模型组395.40±0.70a95.53±0.90a 注：与正常组比较a P<0.05㊂
2.2 芪术颗粒对LSECs 开窗的影响
扫描电镜下可清晰观察到LSECs 的窗孔，正常组窗孔数多，而且整齐，模型组窗孔数少而稀疏，经药物血清处理后，芪术颗粒组有所恢复，尤以大剂量组明显(见图
2)㊂
注:A 正常组LSECs，加正常不含药血清;B 模型组，造模LSECs，加正常不含药血清;C 低剂量组：造模LSECs，加低剂量芪术药物血清处理;D 中剂量组：造模LSECs，加中剂量芪术药物血清处理;E 高剂量组：造模LSECs，高剂量芪术药物血清处理
云母板图2 LSECs 扫描电镜图(50μm)
北京科瑞集团2.3 芪术颗粒对LSECs 表型的影响
CD31和SE⁃1是常用的血管内皮标志物，在正
常肝脏中很少表达㊂然而，这些指标在肝窦毛细血管化后肝纤维化的表达增加㊂Western Blot 检测各
组窦内皮细胞CD31和SE⁃1的表达㊂结果表明,CCl 4组窦内皮细胞CD31和SE⁃1的表达明显高于正常组㊂芪术颗粒后肝窦内皮细胞CD31和SE⁃1表达明显降低(P <0.05)，结果表明，芪术颗粒可抑制肝纤维化大鼠肝窦内皮细胞CD31和SE⁃1的表达(图3㊁表2)㊂
2.4 芪术颗粒对肝窦内皮细胞整合素αVβ3⁃FAK⁃Ras /MAPK 信号通路的影响
与正常组相比，模型组LSECs 整合素αⅤβ3蛋
白水平显著升高(P <0.05),FAK㊁MAPK 蛋白表达水平均升高(P <0.05)，提示整合素αⅤβ3㊁FAK㊁MAPK 蛋白在LSECs 中的表达明显增强(P <0.05)㊂
与模型组相比，低㊁中㊁高剂量均能抑制整合素αⅤβ3㊁FAK㊁MAPK 蛋白的表达，同时能够抑制p⁃FAK 和p⁃MAPK 的表达(P <0.05)，并表现为一定的剂量
依赖关系(见图4㊁5，表
3)㊂
注:A 对照组,B 模型组,C 芪术低剂量组,D 芪术中剂量组,E 芪术高剂量组㊂
图3 各组LSEC 中SE⁃1和CD31的表达表2 各组细胞CD31与SE⁃1表达结果(x ±s )
组别n CD31SE⁃1正常组30.10±0.010.13±0.01模型组30.57±0.02a 0.52±0.03a 芪术低剂量组30.50±0.02ab 0.37±0.02ab 芪术中剂量组30.45±0.03ab 0.28±0.02ab 芪术高剂量组
3
0.35±0.02ab
0.20±0.03ab
注：与正常组比较a P <0.05，与模型组比较b P <0.
05㊂
注:A 对照组,B 模型组,C 芪术低剂量组,D 芪术中剂量组,E 芪术高剂量组㊂
图4 芪术颗粒对p⁃MAPK 与p⁃FAK
蛋白表达情况的影响
注:A 对照组,B 模型组,C 芪术低剂量组,D 芪术中剂量组,E 芪术高剂量组㊂
图5 芪术颗粒对整合素αⅤβ3㊁FAK㊁MAPK
蛋白表达情况的影响
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