Rt－PCR实验操作步骤
RT-PCR实验操作步骤 （转）
默认分类 2007-12-25 17:51:05 阅读233 评论1 字号：大中小 订阅
一.所用试剂
1.0.01MPBS缓冲液,PH7.4 ：高压灭菌，40C保存。临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。 2.焦碳酸二乙酯(DEPC)：sigma公司，40C保存。
电视指南
3.0.1%DEPC处理的灭菌去离子水：100ml去离子水中加入0.1mlDEPC，剧烈振荡混匀，让DEPC充分进入溶液中，370C放置过夜，高压蒸汽灭菌30分钟除去DEPC。40C保存。 4.单相细胞裂解试剂TRizoL：Invitrogen生命技术公司，40C保存。临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。 5.氯仿：用新开封的，10ml分装，40C保存。临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。
6.异丙醇：用新开封的，20ml分装，40C保存。临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。
7.0.1%DEPC处理的75％乙醇：无水乙醇75ml加0.1%DEPC处理的灭菌去离子水至100ml，4C保存。临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。
8.cDNA反转录试剂盒：MBI公司，－200C保存。
9.2xPCR试剂：MBI公司，－200C保存。
10.5xTBE RNA电泳缓冲液：因为Tris碱可与DEPC发生反应并使之失活，所以含Tris碱的电泳缓冲液可用DEPC处理的灭菌去离子水配制，0.22um滤器过滤除菌。室温保存，临用前用DEPC处理的灭菌去离子水10倍稀释。使用本室RNA专用电泳槽，每次需配制0.5x电泳缓冲液500ml。
11.50xTAE DNA电泳缓冲液：室温保存，临用前用去离子水50倍稀释。使用本室DNA专用电泳槽，每次需配制1x电泳缓冲液1000ml。
12.6x上样缓冲液：1.5mlDEPC处理的灭菌离心管中称取2.5mg溴酚蓝，加入0.3ml甘油，DEPC处理的灭菌去离子水定容至1ml，40C保存。
13.1.5％琼脂糖：RNA电泳，1.5g琼脂糖加入0.5xTBE RNA电泳缓冲液中;DNA电泳, 1.5g琼脂糖加入1xTAE DNA电泳缓冲液中。微波炉煮沸熔化后，冷却至600C左右，每100ml胶加入溴化乙啶(EB,10mg/ml)5ul。
14.溴化乙锭（10mg/ml）：在100ml水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕瓶中，保存于室温。
15.人淋巴细胞分离液：上海华精生化试剂厂。
二.总RNA提取
[注]1.本方法采用Chomczynski一步法，用单相细胞裂解试剂TRizoL破碎细胞和灭活细胞中内源性RNA酶同步进行，可同时分离RNA、DNA和蛋白质。TRizoL中含有酚、强变性剂硫氰酸狐和溶解剂等。本法所提取的RNA可用于RT-PCR、Northern印迹杂交等。
2.最好单独存放用于RNA实验的试剂，以防止污染。
3.耐高温的匀浆器、研钵及研棒用锡箔纸包好，2000C干烤5小时，灭活外源性RNA酶。
4.离心管、头等塑料制品用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡12小时以上灭活外源性RNA酶。再用去离子水浸泡10分钟x3次，以去除DEPC，然后70-800C烤干，高压蒸汽灭菌30分钟除去残留的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。
5.提取RNA所用的去离子水及配制试剂均要经含0.1%DEPC处理。
6.如果是从完整包装中新取出的塑料制品，一般无外源性RNA酶污染，可以直接使用。
7.实验者的双手是外源性RNA酶的重要污染源，因此务必戴手套进行操作。
8.DEPC为可疑致癌物，且有芳香性挥发气味，使用时应戴手套、口罩，并打开排气扇。
学习兴趣与学习习惯的培养
9.RNA紫外分光光度计定量所用石英比皿使用后，在1：1盐酸甲醇中浸泡30分钟以上，再用0.1%DEPC处理去离子水冲洗干净，凉干。
10.用于RNA电泳的电泳槽用去污剂清洗干净，自来水冲洗数次，再用去离子水冲洗1次，无水乙醇擦洗，干燥。然后灌满3％的双氧水室温放置10分钟，最后用DEPC处理的去离子水冲洗3次。
11.提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳后，28S rRNA和18S rRNA应当能清楚地在紫外分析仪下看到，也应当能看到一条由tRNA, 5.8S rRNA和5S rRNA组成的，较模糊迁移较快的带。如果RNA没有被降解，28S rRNA的亮度应当是18S rRNA亮度的两倍，且这两条带都没有弥散现象。加样孔附近有条带表明产物中混有DNA。
(一).培养细胞中RNA提取
1.贴壁生长的细胞：倒出培养液，加5ml无菌冰冷的PBS缓冲液冲洗细胞2次。倒出PBS缓冲液(尽量空干)，加入1mlTRizoL,用力振荡培养瓶或培养皿(贴壁较牢固的细胞可用细胞刮刀刮取细胞)，使细胞完全脱落，用加样器吹打均匀，吸入1.5ml离心管中，漩涡混匀器振荡30秒，室温静置5分钟，使核蛋白完全从核酸上解离。悬浮生长的细胞：细胞悬液倒入10-15ml离心管，2000转/分离心10分钟收集细胞，倒出培养液，加2ml无菌冰冷的PBS缓冲液，混匀使细胞沉淀重悬洗涤细胞2次。再2000转/分离心10分钟收集细胞，倒出PBS缓冲液(尽量空干)，加入1mlTRizoL,用加样器吹打均匀，吸入1.5ml离心管中，漩涡混匀器振荡30秒，室温静置5分钟，使核蛋白完全从核酸上解离。
2.加氯仿200ul,漩涡混匀器振荡30秒，冰盒上静置10分钟，
3.高速冷冻离心机（温度设定40C）12000/分离心15分钟，使混合物分为两相(RNA留在水相，DNA和蛋白质被抽提进氯仿层)，吸取上层水相0.5ml移至一个新的1.5ml离心管中，加异丙醇0.5ml。充分混匀，冰盒上静置10分钟，使RNA充分沉淀。
4.高速冷冻离心机（温度设定40C）12000/分离心15分钟,弃去上清液,加入冰冷75%乙醇1ml洗涤RNA沉淀,漩涡混匀器振荡30秒.
5.高速冷冻离心机（温度设定40C）8000/分离心5分钟,弃去上清液,沉淀快速风干。但不要完全干燥这一点非常重要，否则RNA沉淀溶解度会大大降低。可通过在55－600C加热并用头反复吹打溶液增加RNA的溶解度。
6.提取的RNA加适量DEPC处理去离子水溶解(组织及培养细胞所提RNA加水50－100ul外周血白细胞所提RNA加水10－15ul)。取5ul+1ul6x电泳上样缓冲液点样，电压120-130V电泳30分钟左右，如在紫外分析仪下可见5S、18S及28S三条带出现，说明已提出RNA。5S条带较模糊迁移较快。如果RNA没有被降解，28S rRNA的亮度应当是18S rRNA亮度的两倍，且这两条带都没有弥散现象。加样孔附近有条带表明产物中混有DNA。RNA纯度鉴定及定量可用紫外分光光度计，取2ul＋148ul去离子水测A260nm/280nm，比值应在1.8-2.0
之间。RNA浓度(ug/ml)=A260x稀释倍数x40。对大多数细胞株来说，一个100ml培养瓶中培养细胞的RNA收率为100－200ug。
7.如暂时不做反转录，,立即放-800C冰箱冻存。
贴壁细胞总RNA提取操作流程
马克思劳动价值论I
细胞长满80%瓶底或皿底，换培养液，第二天提取RNA
(倒掉培养液，5-10ml冰PBS洗涤细胞2次空干)
添花核心加1ml冰TRizoL,用力振荡培养瓶使细胞完全脱落，加样器吹打
(吸入1.5ml离心管，旋涡振荡10秒，室温静置5分钟)
琼脂糖凝胶
加氯仿200ul,漩涡混匀器振荡10秒，冰盒上静置10分钟
(40C,8000rpm,5分钟，)
吸取上层水相0.5-0.7ml移至另一1.5ml离心管中，加异丙醇0.5-0.7ml
(充分混匀，冰盒上静置10分钟，40C,12000rpm,15分)
弃上清,加75%冰乙醇1ml, 颠倒混匀数次
输液恒温器
(40C,12000rpm,15分)
弃上清,沉淀快速风干。但不要完全干燥, 加DEPC处理去离子水50-100ul
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