血液标本收集和保存..
血液标本的收集和保存方法
说明：一般建议用新鲜的血液标本进行实验。如果标本已经保存较长时间，请联系康成公司技术部，以确认样本是否适合进行实验。
一、 全血收集
请按照实际使用的收集方法，如注射器收集或真空收集管等，参考相应的厂商提供产品说明进行操作。采集好全血，将采集好的全血转移至单独的冻存管，按照每400~500ul/管分装好。短期保存，可放入- 20°C 或- 70°C冰箱。长期保存，请放入液氮。 为获得血浆进行实验，应使用抗凝管采集全血，并尽快进行血浆分离：1000g离心10分钟，分离血浆和细胞组分。将采集好的血浆转移至单独的冻存管，按照每400~500ul/管分装好。短期保存，可放入- 20°C 或- 70°C冰箱。长期保存，请放入液氮。
图片来源：Exiqon ‘ Quantification of MicroRNA expression in Blood Plasma/Serum Samples’
注意：血浆收集应使用抗凝管，抗凝剂可以用柠檬酸钠或EDTA等，但一定不要使用肝素抗凝，因为肝素对RNA实验有较大影响
三、 血清收集
为获得血清进行实验，应使用凝血管采集全血，采血后两小时内分离血清。采血后轻轻倒转采血管混合4~5次，直立置于室温待血液完全凝固（一般约一小时），1000g离心10分钟，
分离血清。将采集好的血清转移至单独的冻存管，按照每400~500ul/管分装好。短期保存，可放入- 20°C 或- 70°C冰箱。长期保存，请放入液氮。
四、 血清、血浆和全血样本的保存和运输
→ microRNA芯片检测血清、血浆或全血标本约需要1~2ml的量（即每份样品2~4管）。 →在样品保存及转移的过程中，应避免反复冻融样品。
→运输过程必须使用足量干冰保证始终低温。干冰量至少为8公斤（足量），且运输用厚壁泡沫箱，且需用封箱带密封。
注：
保存血清，血浆或者全血所使用的1.5 ml冻存管或离心管，操作中使用的头等必须高温灭菌，装好样品后管口需要以封口膜封好。
参考文献：
1. Signature microRNA Expression Profile of Essential Hypertension and Its Novel Link to Human Cytomegalovirus Infection. Li S., et al., Circulation, 2011.
2. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Xi C., et al., Cell Research, 2008.
附：TRI抽提RNA protocol
→如果条件允许，亦可采用TRI Reagent BD保存全血、血浆和血清，并抽提其中的RNA
→TRI Reagent BD（For processing whole blood, plasma, or serum）可以从Sigma或者MRC(Molecular Research Center)订购
1、RNA的抽提
采用TRI Reagent BD从全血、血浆和血清中抽提RNA，整个过程可以在1小时内完成，完整的RNA的得率比其他的抽提方法高30－150％。其他方法抽提的RNA的完整性都不如TRI Reagent BD，特别是采用柱离心式抽提方法很可能改变RNA的组成。TRI Reagent BD尤
其适用于抽提病毒RNA。抽提得到的RNA可用于northern、dot blot bybridization、poly A＋ selection、in vitro translation、RNase protection assay、molecular cloning和PCR。
实验方法
卵磷脂小体
需要自备的试剂：1‐bromo‐3‐chloropropane（溴氯丙烷，BCP）或氯仿、异丙醇、乙醇和5N醋酸
建议使用一次性的聚丙烯离心管，并可承受12,000g离心。
1、裂解：0.75ml TRI Reagent BD＋0.2‐0.25ml全血、血浆或血清
2、两相分离：裂解液＋0.1ml溴氯丙烷或0.2ml氯仿
3、RNA沉淀：水相层＋0.5ml异丙醇
4、洗RNA：1ml 75％ 乙醇
mse
5、RNA溶解：FORMAzol、0.5% SDS、或水碱法
实验在室温中进行，除非特定步骤。
1、裂解
巴利语A、血清：加入0.25ml血清和2‐8ul Polyacryl Carrier（Cat.No.PC152）到0.75ml TRI Reagent BD中，关于地方政府职能转变和机构改革的意见
盖上盖子，用手或震荡器晃动离心管直至充分混匀。
B、全血或血浆：加入0.2ml全血或血浆到0.75ml TRI Reagent BD，每0.2ml全血或血浆添加20ul
5N 醋酸，盖上盖子，用手或震荡器晃动离心管直至充分混匀。
醋酸可以在混合血液样品前的TRI Reagent BD中添加，也可混合后添加。用1ml冰醋酸（>99％）与2.48ml水混合制备5N的醋酸。样品体积与试剂体积的比例始终与上述实验方法中一致。样品体积过大会导致DNA污染，而体积太小则有可能获得过于少量的RNA。
注意：使用TRI裂解样品后，样品干冰运输，或于－70℃存放数月，至进行后续实验。
2、两相分离
将裂解液室温放置5分钟，使得核蛋白复合物充分解离。接下来，每0.75ml裂解液中添加0.1ml 溴氯丙烷或者0.2ml氯仿，盖紧盖子，剧烈晃动15秒。混合液室温放置2‐5分钟，12,000g，4℃离心15分钟。离心后，混合物分为下部褐的酚-氯仿相、中间相和上部无的水相。RNA保留在水相中，DNA和蛋白分别在中间相和有机相中。水相层的体积大约为用于裂解的TRI Reagent BD试剂体积的60％。
用溴氯丙烷代替氯仿不会影响RNA、DNA和蛋白的质量，并且可以降低DNA污染RNA的可能性（4）。用于两相分离的氯仿不能含有异戊醇或者其他添加物。
很重要的一点是必须要冷冻离心（4-10℃）。如果离心温度过高，DNA就有可能残留在水相中。这种情况下得到的RNA可以用于northern分析，但是不能用于PCR。
3、RNA沉淀
将水相层转移到新的离心管中，中间相和有机相储存在4℃以备后续实验用。向水相中加入异丙醇混匀，沉淀RNA。每0.75ml TRI Reagent BD分离得到的水相中加入0.5ml异丙醇。
室温放置5‐10分钟，12,000g，4‐25℃离心8分钟。RNA沉淀在管底呈现为胶状或白沉淀块。
4、清洗RNA琼脂糖凝胶
吸掉上清，加入75％乙醇，涡旋振荡重悬RNA沉淀。每0.75mlTRI reagent BD试剂抽提得到的RNA用1ml75％乙醇清洗。若前面的分离步骤在大离心管（>2ml）中进行的话，则将RNA‐乙醇悬液转移到小离心管中。转移时使用口径处减掉2‐3mm的1ml头。7,500g，4‐25℃离心5分钟。如果RNA沉淀在管壁上或者不能贴壁，那么使用12,000g离心。
5、溶解RNA
吸掉乙醇，将RNA沉淀自然风干5分钟。很关键的一点是不能让RNA彻底干燥，否则会降低RNA的可溶性。不要采用真空装置离心干燥RNA。用FORMAzol（ FO121）、水或者用头吹打混匀配制而成的0.5％SDS溶液溶解RNA，55‐60℃温育10-15分钟。用于溶解RNA的水或者SDS溶液必须先用DEPC处理。在用于RT-PCR之前，用FORMAzol溶解的RNA必须用乙醇沉淀出来。若用FORMAzol溶解RNA的话则不必干燥RNA。
6、结果
用EB染琼脂糖凝胶电泳分离的RNA，或者用亚甲基兰染转移到杂交膜上的RNA，可以看到两条主带，分别为2kb和5kb的rRNA，另外还有一条0.1‐0.3kb的小分子量的RNA。关键的是最终制备得到的RNA应该没有DNA和蛋白污染，260/280的比值应该在1.6‐1.9之间。如果用于RT‐PCR 分析，用Dnase消化对于得到理想的结果是很重要的。一般来说，从1ml人的全血中可以分离出15‐20ug总RNA。要想获得理想的分光光度计测定值，RNA最好用pH.>7.5的水或者缓冲液（例如磷酸缓冲液 SP130）来稀释。若用pH<7的蒸馏水来测量会导致260/280比值降低则干扰我们判断RNA中是否有蛋白的污染（6）。
注意事项
1、在0.75ml TRI reagent BD中添加2‐8ulPolyacryl Carrier（Cat.No.PC152）有利于抽提小体积
（<0.2ml）的血液样品中的RNA。如果样品体积<0.2ml，要么用血清将样品体积调整到0.2ml，要么按<0.2ml的样品体积相应地减少试剂使用量。当抽提全血或者血浆的RNA时，每0.1ml 全血或者血浆中加入10ul 5N醋酸。
2、在加入溴氯丙烷或氯仿前，TRI reagent BD的裂解液可以在‐70℃存放数月。RNA沉淀（步骤
4中的RNA）可以在75％乙醇中、4℃存放至少一周，-20℃则至少可存放一年。
3、若血液样品存放在4℃时，细胞中的RNA会快速降解。为了抽提到完整的RNA，采集样品的
过程必须迅速分装、冻存在-70℃，不管样品是否用TRI reagent BD处理。病毒样品可以在4℃存放数天。
4、手和灰尘是Rnase最大的污染源。整个实验过程中务必使用手套并盖紧离心管盖。
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