凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。丹江口水电站
葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。可分离的分子量范围从几百到几十万不等。
查重葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻和数字频率计设计
完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。
制备：
Sephadex G200是分子筛填料（sephadex G-200葡聚糖凝胶 G-200 分离范围 5000-600000 适用于蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定），上柱时只要恒定的流速，不用洗脱的，根据多糖的大小，出峰顺序不一样的，减少上样量、降低流速、增加高径比都能提高分辨率（如果从制备的角度，还要综合考虑分辨率和制备能力capacity ，必要时候需要牺牲一定的分辨率，在过载条件下操作。例如，流速就不是越低越好。） 在制备时，确实应该综合考虑resolution和capacity，如果两者不能很好协调的时候，应该牺牲的是capacity，而不是resolution。
分子筛一般主要是两大用途：除盐和分离，对于前者要求不是很严，sephadex G25 G50 都是专门用来除盐的，载量最高可以达到柱体积的20%，而且对于流速等条件的要求都不高。
分子筛层析如果用来分离不同大小的蛋白或多糖一般是用在后面的精纯化阶段。
平常纯化的时候不到万不得已是不会用到分子筛的，因为它的上样量很小，而且做一次需要的时间也很长，与离子交换、疏水或反向等比起来太费时费力，这时用分子筛来分离首先考虑的就是它的分辨率。当然在保证分辨率的情况下通过增加流速、增加上样量等方法来提高capacity是最好的。如果上述条件的改变影响了resolution和recovery，最好是在保证resolution和recovery的情况下少量多次进行层析分离。
离子交换谱洗脱主要是两种方式，第一种是增加缓冲中的盐离子浓度，这些离子会和蛋白竞争性的与配基吸附，随着离子强度的增大，洗脱离子依靠数量上的优势优先与配基结合，从而使不同离子特性的蛋白洗脱；第二种方式是通过改变pH的方法改变蛋白自身的带电特性，这时由于蛋白自身带电性质的改变，不用盐离子竞争性吸附，它自身就会从配基上解离。一般离子交换洗脱的时候优先考虑用增加离子强度的方法进行洗脱，因为通过改变pH的方法使蛋白解离一般会经过蛋白的pI，这时蛋白溶解度降低会降低，会存在沉积到填料上的危险（使用极高或极低的pH应能把蛋白洗脱下来，但同样涉及到蛋白在该pH的稳定性问题）。用增加离子强度的方法进行洗脱有时会使疏水性特别强的蛋白出现盐析，从而沉淀在填料上。这时一味增加盐离子强度无法使蛋白洗脱的，此时只能把盐离子强度降低，用改变pH的方式进行洗脱。
用g200填料分离纯化多糖不用恒流泵的话极慢，并且用恒流泵的话，g200的填料就会漏，在柱下面加了两层膜还有少许的填料漏出。是因为sephadex系列的填料刚性不好，g75以上的填料早就停止生产了，G后面的数字越大、刚性越差。是填料本身性质带来的，漏出来的是破碎的填料。这时难有分离效果的。建议更换填料，如sephacryl S 200或 S300之类的刚性要好的多。
一般如果分离的多糖跟填料没有吸附作用的话用水洗托就可以了，如果有吸附可以用0.15的NaCl洗托。用盐还是水来洗脱，主要取决于多糖是否带电荷等情况。假设多糖是中性的，盐的存在与多少对于洗脱影响不大；但是，如果是酸性糖，则可能与基质的非体积排阻效应（主要是电荷相互作用）较大，需要用适当高些的盐溶液来完成。
葡聚糖凝胶物理化学性质
化学稳定性：葡聚糖那不溶于一切溶剂（除非它被水解），在水、盐溶液、有机溶剂、碱和弱酸性溶液中都有很好的稳定性，在强酸中凝胶骨架的糖苷键被水解。长期接触氧化剂容易破坏凝胶，所以应该避免使用。在湿空气中易长霉，可用氯仿、甲苯、叠氮钠做防腐剂。
物理稳定性：葡聚糖凝胶并不熔融，可以在湿态、中性pH进行灭菌或者高压灭菌120°C，30分钟不影响它的谱性质。干态的凝胶加热至120°C以上开始焦糖化。
储存方法：
1、未使用，室温保存即可。
2、使用后保存方法如下：凝胶层析的载体不会与被分离的物质发生任何作用，因此凝胶柱在层析分离后稍加平衡即可进行下一次的分离操作。但使用多次后，由于床体积变小，流动速率降低或杂质污染等原因，使分离效果受到影响。此时对凝胶柱需进行再生处理，其方法是:先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲溶液平衡，即可进行下一次分离。对使用过的凝胶，若短时间保存，只要反复洗涤除去蛋白质等杂质，加入适量防腐剂即可；
3、若长期保存，则需将凝胶从柱中取出，进行洗涤、脱水和干燥等处理后，装瓶保存。
使用方法
1凝胶预溶胀
琼脂糖凝胶
在凝胶使用前，首先将其溶胀，具体方法：室温下，将干粉浸泡在超纯水中充分溶胀24小时，并不断搅拌保证凝胶 充分溶胀；或者在室温下，将干粉浸泡在50-60%乙醇中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶完全溶胀，用超纯水洗去乙醇；
2装柱
将溶胀好的凝胶根据装柱要求一次性注入柱内，注意要避免柱内产生气泡或者断层，保持湿态装柱，可在凝胶可承受的操作压下装柱，保证装柱均匀，装完柱可以检测柱效，检查凝胶装填是否合格。
3平衡
上样前用平衡液平衡层析柱至少3-5个柱体积直到基线平稳；
4上样
凝胶过滤的上样量一般为5%的柱床体积，初次上样建议控制在1-2%的床体积，视分离情况可以调整；脱盐时上样量可以达到20%的柱床体积，柱高的选择也与分离要求相关，柱
高控制在40-50cm以下，过高的凝胶层会引起较大的反压，应当尽可能避免。难分离物质要有一定柱高和流速控制，脱盐时高径比为5：1即可
5洗脱方法
可以用无盐水也可以采用上柱时的缓冲液洗脱；在上柱Buffer中加入NaCl等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以完全分离纯化；
6在位清洗（CIP）
凝胶使用十次后作一次CIP，目的是去除柱床内沉淀及顽固残留的蛋白。以40cm/h用1M氢氧化钠反向洗四个柱体积，再以至少三个柱体积平衡缓冲液再生。
7保存
凝胶使用完后可回收，将凝胶用超纯水冲洗干净并滤干，加入0.02%叠氮钠做为防腐剂，或者浸泡在20%的乙醇中，防止长菌。
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⒈凝胶的选择
根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用SephadexG-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。
⒉柱的直径与长度
根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。
马提尼克岛 长高⒊凝胶柱的制备
凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。
凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有物质来观察带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。
⒋加样和洗脱
凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5％-10％。样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提
高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2.样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。
⒌凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存
一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02％的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。
如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70％、90％、95％乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90％以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。
【实验操作】
1.实验凝胶的制备：商品凝胶是干燥的颗粒，使用时需经溶胀处理，称取4克葡聚糖凝胶G—25，加50毫升蒸馏水，搅拌均匀，在室温溶胀6小时，或沸水浴溶胀 2小时，一般采用后一种方法。再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，用蒸馏水反复洗涤几次，再以缓冲溶液(pH7.0的Tris—醋酸溶液)洗涤2—3次，使pH和离子强度达到平衡，最后抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡，凝胶可保存在缓冲液内。
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