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PCR的实验步骤

总RNA的抽提

1.匀浆 1份样本+3份抽提剂，加样吹打几次，剧烈涡旋混匀至少1分钟，在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。

2.样品可在-60℃~-70℃保存至少1个月。

3.分离 15份抽提剂+4份氯仿，用力摇晃试管15秒，在30℃条件下孵育2-15分钟，2-8℃下以不超过12000*g的离心力高速冷冻离心15分钟。

琼脂糖凝胶4.沉淀将水样层转移到一干净的试管中，3份抽提剂+2份异丙醇，在15 -30°C条件下孵育10分钟并在2~8°C下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心10分钟。

5.漂洗移去上层悬液。3份抽提剂+至少4份75%乙醇。溶于75%的乙醇在2~8°C至少可以保存一周，在–5~–20°C下至少可保存一年。旋涡振荡混合样品并在2~8°C下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟。

6.再溶解空气干燥或真空干燥5~10分钟，分几次移取无RNA酶的水来溶解RNA，并在55~60°C下孵育10分钟。

RNA完整性检测

1.电泳缓冲液 Tris 242g+乙酸 57.1ml+0.5M EDTA200ml→→dH2O 补足至1000ml （贮存液），使用时按1：49的比例稀释成工作液。

2.制胶 ②(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,④将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液加入溴化乙锭，充分摇匀（即成1.0%琼脂糖凝胶液）。

3.制板 ①取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干；③放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在距离底板0.5～1.0mm的位置上放置梳子；④将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上（凝胶的厚度在3～5mm之间）,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层；⑤如何正确对待金钱室温下静置（30min左右）直至凝胶完全凝固,当胶正凝固时，准备RNA样品并取适量

（如5μl）加1μl加样缓冲液混合，加样液中包含染料溴酚蓝BPB；⑥垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中，加样孔一侧靠近阴极（黑末端），注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面1cm。

4.加样加RNA样品及时进行电泳使吸管与加样孔垂直（使吸管尖端刚好在加样孔开口之下）缓慢将RNA样品加入加样孔中。

5.电泳加样完毕后，正确连接电泳槽和电源（黑的连阴极、红的连阳极），在打开电源之前设定好电压和时间，电压100mV, 时间30min。负极附近的铂丝会有气泡产生。

6.凝胶摄影

7.测纯度和浓度

反转录

1. 去除基因组DNA反应于冰上配制反应混合液｛2(2ul）+1(1ul)+6(?ul)+RNA(不超过1ug)｝，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。42℃ 2 min（或者室温5 min*2），放于4℃。

2. 反转录反应在冰上进行，先按反应数+2的量配制Master Mix｛3（1ul）+5(1ul)+4(4ul)+6(4ul)｝，然后再分装10 μl 到每个反应管中，轻柔混匀后立即进行反转录反应。37℃ 15 min, 85℃ 5 sec,放于4℃。

qRT-PCR

1. 反应液配制在冰上进行，配置的预混液体积要至少多于所有反应用总体积的10%。菱形

2. 按照不同仪器的操作进行。

琼脂糖凝胶浓度	线形DNA的最佳分辨范围
0.5%	1,000～30,000
0.7%	800～12,000
1.0%	500～10,000
1.2%	400～7,000
原油密度 1.5%	200～3,000
2.0%	50～2,000