琼脂糖凝胶电泳配方与步骤(精)

配制:

1. 0.5M EDTA(pH=8.0 :

100ml :称取 18.61g Na 2EDTA ·2H 2O (分子量 372.24 ,加 80ml ddH 2O 剧烈搅拌, 用 NaOH 调节 PH 值至 8.0(约需 2g NaOH . 高压灭菌,室温保存。

2. 50×TAEloading buffer:(Tris acetate-EDTA buffer 电泳缓冲液

组分:2MTris-乙酸;100mM EDTA(pH=8.0

麦博fc330500mL:称 121.1g Trisbase(分子量 121.14 ,加 800ml ddH 2O 溶解,加 57.1ml 乙酸和 50ml 0.5M EDTA 溶液(pH=8.0 ,搅拌, ddH 2O 定容至 500mL . 室温保存。

3. 1×TAEloading buffer:

琼脂糖凝胶

取 20ml 50×TAE, ddH 2O 定容至 1L. 室温保存。

4. 100×Sybergreen :

500ul :取 495ul 1×TAE于 1.5ml 离心管,加入 5ul Sybergreen 原液混匀,4℃锡纸避光保存。

注意:Sybergreen 原液需稀释 10000倍;

6×DNAloading buffer 上样缓冲液需稀释六倍,最终稀释倍数应不小于 1×。步骤:

1. 制备 1%琼脂糖凝胶 (大胶用 70ml, 小胶用 50ml ,我们用 30ml:

称 0.3g 琼脂糖置于 100ml 锥形瓶中,加入 30ml 1×TAE ,瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸 3次,至琼脂糖全部融化,摇匀,即成 1.0%琼脂糖凝胶液。

2. 胶板制备 :

取电泳槽内的有机玻璃内槽 (制胶槽洗干净 , 晾干 , 放入制胶玻璃板 . 取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好 , 形成模子 . 将内槽置于水平位置 , 并放好梳子 .

将冷却到 65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上 , 使胶液缓慢展开 , 直到整个玻璃板表面形成均匀胶层 . 室温下静置直至凝胶完全凝固 , 垂直轻拔梳子 , 取下胶带 , 将凝胶及内槽放入电泳槽中 . 添加 1×TAE 电泳缓冲液至没过胶板为止 . 3. 加样 :

样品制备:(10ul 体系 /样品槽于 0.25ml 离心管中

样品 RNA (最后加 :2ul /3ul/5ul

6×DNA loading buffer:10/6=1.7ul

100×Sybergreen :0.1ul

DEPC 水:至 10ul

岩矿分析与鉴定(注意 :加样前要先记下加样的顺序 . 分别将样品加入胶板的样品小槽内 , 每加完一个样品 , 应更换一个头 , 以防污染 , 加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面 .

4. 电泳 :

加样后的凝胶板立即通电进行电泳 , 电压 60-100V , 样品由负极 (黑向正极 (红方向移动 . 电压升高 , 琼脂糖凝胶的有效分离范围降低 . 当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约 1cm 处时 , 停止电泳 .

杨苏萍

crt5. 电泳完毕后 , 取出凝胶 , 利用科 212凝胶成像系统 , 在紫外灯(trans UV 下观察拍照保存 .DNA 存在则显示出红荧光条带 . RNA 完美提出应该是三条带:28, 18, 5.8。 28和 18比较亮 , 而且 28是 18亮度的 2倍 ,5.8基本很模糊,可有可无

本文发布于:2024-09-20 13:23:26，感谢您对本站的认可！

标签：凝胶琼脂糖样品玻璃板胶板电泳

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