张清华
艾民
1
蒋知新沙杭高毅
2
卢海
2
（中国人民解放军三零五医院，北京100017）
〔摘
要〕目的利用包装生产逆转录病毒感染原代培养人皮肤成纤维细胞，为细胞重编程提供技术保证。方法
利用组织块贴壁法体外原
代培养人皮肤成纤维细胞。包装生产携带绿荧光蛋白GFP 基因的逆转录病毒上清液。收集逆转录病毒上清液感染原代培养人皮肤成纤维细胞，利用荧光显微镜观察逆转录病毒感染成纤维细胞。结果体外成功原代培养出人皮肤成纤维细胞。293T 细胞包装生产携带GFP 基因的逆转录病
通古斯语
毒上清液。包装生产后逆转录病毒成功地感染原代培养人皮肤成纤维细胞。结论
逆转录病毒介导系统是人皮肤成纤维细胞重编程的有效基因转
移载体。
〔关键词〕逆转录病毒；人皮肤成纤维细胞；细胞重编程；诱导多潜能干细胞〔中图分类号〕R34
〔文献标识码〕A
〔文章编号〕1005-9202（2012）11-2297-02；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.11.039
基金项目：全军医药卫生科研基金项目（No.08Z017）；科学技术部867
计划项目（No.2006AA02A141）
1
南方医科大学研究生院2
南方医科大学再生医学研究所
通讯作者：蒋知新（1963-），男，副主任医师，硕士，硕士生导师，主要从
事心血管病研究。
第一作者：张清华（1950-），男，主任医师，教授，博士生导师，主要从事
冠心病干细胞研究。特钢厂
胚胎干细胞（ESCs ）是具有无限增殖，自我更新和多向分化潜能的一种未分化细胞，在体外可被诱导分化为神经细胞〔1〕
头孢曲松、
弹道学报平滑肌细胞、心肌细胞
〔2〕
、造血细胞〔3〕
而用于多种疾病的，
具有广阔的研究和临床应用前景。目前，
ESCs 研究也存在着一些问题，
如免疫排斥反应和伦理学问题的争论。诱导多潜能干细胞技术是将多能性基因转染到已分化的体细胞，将其重编程为类似于ESCs 的多潜能干细胞，并被命名为“诱导多潜能干细胞”（iPSCs ），简称“iPS 细胞”〔4〕
。iPS 细胞回避了ESCs 免疫排斥反应和伦理学的争论问题，近年来成为干细胞领域的研究热点。本实验拟采用包装生产携带绿荧光蛋白（GFP ）基因的逆转录病毒感染原代培养人皮肤成纤维细胞（HSF ），判断逆转录病毒对HSF 细胞的感染情况，为下一步HSF 细胞重编程实验提供技术保证。1材料与方法1.1
野生动植物资源保护与利用
材料与主要试剂
皮肤标本来源于南方医科大学第二临
ips细胞
床学院，经患者及其家属同意签字后方可取标本。高糖型DMEM 、10%FBS 、PBS 、明胶、pMX-GFP 、pCL 包装质粒、poly-brene 、磷酸钙转染用试剂盒。1.2
原代培养HSF 细胞
〔5〕
手术取患者上臂内侧至真皮层
2cm ˑ2cm 皮肤组织标本，用PBS 将组织标本清洗3遍后剪碎至1mm ˑ2mm 左右，将其平铺到包被明胶的培养皿中，添加
HSF 细胞培养基（高糖型DMEM +10%FBS ），置于37ħ5%CO 2培养箱培养，每天更换HSF 细胞培养基。1.3
包装生产逆转录病毒
采用磷酸钙转染法将GFP 基因
转染到293T 细胞内，具体步骤如下：先加水，再加pMX-GFP 和pCL 包装质粒混匀。向混合液中加入
2mol /L CaCl 2颠倒混匀。再向混合液中加入2ˑHBS 反复吸吹混匀。在室温下静置2min ，加入等体积的293T 细胞培养基（高糖型DMEM +10%FBS ），将钙转液逐滴均匀滴加到293T 细胞中，置于37ħ，5%CO 2培养箱培养，12 16h 后更换培养液，36 48h 收集病毒上清液。1.4
收集病毒感染HSF 细胞
应用巴氏吸管收集病毒上清
液，经0.45μm 滤过膜过滤到15ml 离心试管中，加入终浓度为8ng /ml polybrene 混匀，感染前更换新的HSF 细胞培养基，将收集过滤的病毒上清液感染HSF 细胞。1.5
HSF 细胞观察
显微镜下观察原代培养HSF 细胞的生
长过程和包装生产逆转录病毒感染HSF 细胞情况，并拍照。2结
果
2.1
原代培养HSF 细胞
人皮肤组织块接种1w 左右，可见
少量的HSF 细胞从组织块周围爬出，呈长梭形、不规则形。2w 左右组织块周围HSF 细胞数量逐渐增多，部分细胞生长密度超过90%，呈放射状、栅栏状或漩涡状排列。见图1。2.2
包装生产逆转录病毒
利用磷酸钙法将pMX-GFP 和pCL 包装质粒转染到293T 细胞，48h 后荧光显微镜下观察，293T 细胞正在包装生产携带GFP 基因的逆转录病毒。见图2。2.3
病毒感染HSF 细胞
收集病毒上清液感染HSF 细胞，
48h 后倒置荧光显微镜下观察，包装生产的逆转录病毒感染绝大多数HSF 细胞，被病毒感染的HSF 细胞能够稳定表达外源性GFP 基因。见图3。
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