iPS制作流程
准备MEF
1 通过颈部脱臼的方式处死13.5天的孕鼠，分离出带胚盘的胚胎，然后无菌分离出胚胎。用PBS轻轻地清洗胚胎两次。 2 去除胚胎的头，四肢和内脏组织用PBS洗剩下的躯干部。
3 将胚胎移到新的3.5cm皿，尽可能地剪碎。
4 加2ml的0.05加EDTA的胰酶，将它们转移到15ml的离心管，在37度培养箱中培养20分钟，轻轻摇动数次离心管，帮助细胞解离。 5 加入5ml的MEF 培养基来终止消化，放置5分钟沉淀细胞，弃上清。 6 加入5ml的MEF 培养基，轻轻吸打十次来吹散细胞。
7 200g室温离心5分钟，弃上清，用新鲜的MEF培养基来重悬细胞
8 每个加了10m的lMEF培养基的10cm皿中移入2x106个细胞，过夜培养。
9 第二天去上清，清除飘着的死细胞。
10 当细胞长满的时候，用1：3的比例传代，或者冷冻细胞。
11 在用逆转录病毒转染产生ips之前一天将每个10cm皿加入2x105个细胞
通过丝裂霉素C处理MEF来制作feeder饲养层细胞
12 培养细胞到90-95%密度
13 加入丝裂霉素C到皿中，使其终浓度为10ug/ml，在培养箱中37度培养2.5小时
14 用10ml的PBS清洗皿两次，去除丝裂霉素C
15 消化细胞，200g离心5min，
16 细胞计数，按1x105个细胞密度加入到铺好一层明胶的每个3.5cm皿。
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慢病毒包装
17 在37度中迅速解冻Plat-E ，但是还留有一半的冰晶。
18 缓慢加入0.5ml的MEF培养基到冻存管中，将混合液移入到装有5mlMEF培养基的15ml离心管中，缓冲DMSO的影响。
19 200g离心5min，去上清
20 轻轻重悬沉淀，加入新的加有Plat-E培养基的皿中，一般10cm皿中加8ml。
21 当细胞长满90-95%时传代，1-5次，两三天传一代。
22 胰酶消化，200g离心5min，去上清ips细胞
平望实验小学23 重悬细胞，每个10cm皿中移入8x106个细胞.准备四个皿，分别装pMXs-Oct4 ，pMXs-Sox2 ，pMXsc-Myc， 和pMXs-Kif。过夜培养
24 加12ml加了10%的G（FBS）但没有加抗生素的DMEM（也可以用OPTI-MEM）到10cm皿。
25 稀释18ug的质粒DNA到2ml的有1.5mlOpti-MEM但没有加血清的吸液管，轻轻吸打均匀。
26 轻轻混匀60ul的脂质体2000到装有1.5ml的Opti-MEM但没有加血清的2ml吸液管中，室温培养5min。
27 将两个吸液管中液体混匀，室温培养20min。
28 将3ml的混匀的培养液逐滴加入到10cm的PlatE培养皿中，轻轻摇匀。
注意：高转染效率有助于容易分离ips细胞，我们用一个pMXs 反转录病毒连GFP的载体来测试转染效率（大约80%）。
29 在培养箱中过夜培养，用15ml新鲜的DMEM加10%G(PBS)混合物（也可以用10%G）换液。
30 在转染48小时之后收集上清，用0.45um的过滤头过滤。向每个PlatE培养皿中加入15ml新的MEF培养基，为了达到最大的转染效率，那些逆病毒培养基应该马上用完，不要饲养和储存太久。
31 转染72小时后收集培养基，用0.45um的过滤头过滤，再次获得二次转染液
得到ips细胞
---第一天 ：逆病毒感染
32 混合四种各2.5ml的收集的逆病毒培养基（包括每种转录因子），摇匀。
33 加凝聚胺溶液到10ml的混合液，使其终浓度为4ug/ml， 轻轻摇匀。
34 弃之前一天准备好的包含成纤维的10cm培养皿的培养基，加10ml加有凝聚胺的第二次感染培养基，过夜培养。
第二天 换新的培养基
35 换液：去ips产生过程中产生的含有成纤维的培养基，加入10ml逆病毒培养基，过夜培养来进一步感染细胞。
第三天 换新的培养基
36 换液：去产生有成纤维的培养基，加10mlDMEM加105FBS的培养基。
37 准备含feeder数量为106的10cm皿。
第四天 传代 改变培养基
38 去培养基上清 ，用PBS洗两次
39 用0.05胰酶消化细胞,200g离心5min.
40 重悬细胞,种到feeder上,密度为每个3.5cm皿2.5x104,加2ml诱导培养基.
第5到13天 换液
41 换液 每天换新的诱导培养基出版管理条例
第14天 筛选ips克隆来建系
42 96孔板每个加25ul的0.25胰酶
43 去培养基上清,用PBS漂洗
44 用10ul的移液器分离ES形状的克隆(圆形,干净的边缘),将每个单个克隆放到96孔板中。
45 37度培养5min消化细胞，加200ulES培养基来终止消化
46 用移液器吸打来分散细胞，将它们转移到含1ml诱导培养基的24孔板中，一个孔养一个克隆。
桂花雨教学设计47 2-4天后，当克隆长大将它们分到3.5cm皿中。将它们记录为p1,并记录细胞系号。
48 每天用ES培养基传代，记录传代数目
饲养ips细胞
49 用PBS漂洗ips细胞。
50 加胰酶，37度等3-5min，直到细胞漂浮。
51 加ES培养基吸打均匀，得到单个细胞
52 200g5min离心
53 吸上清
54 重悬到feeder 媒介上。
55 缓慢冰冻ES细胞
56 临时储存ES细胞（-80度） 或长久储存（液氮）
解冻ips细胞
57在37度中迅速解冻ips细胞，但还留有一半的冰晶。
羟甲基丙烯酰胺18 缓慢加入0.5ml的MEF培养基到冻存管中，将混合液移入到装有5mlMEF培养基的15ml离心管中，缓冲DMSO的影响。
19 200g离心5min，去上清
20 轻轻重悬沉淀，加入新的加有ES培养基的3.5cm的feeder皿中，一般2ml。
61 在下午五点左右在每只8-10周大的CD-1雌鼠通过复膜内显微注射加10U的PMSG
第三天
62 48小时后通过显微注射加10U的hcG，让小鼠交配
第四天
63 早上八点选取交配成功的雌鼠以便收集囊胚
第五天
64 处死受孕小鼠，用剪刀和镊子轻轻剥取输卵管。用H-CZB洗两次。将输卵管移到装有H-CZB的培养皿中，剥离，收集2细胞时期的胚胎。
65 电击融合二细胞，使其成为一个四倍体的胚胎。电击融合之后在CZB培养基上培养四倍体胚胎。一小时后，分离那些没有融合的胚胎。转移确认的四倍体胚胎到新的带有谷氨酰
胺的CZB培养基中。培养48小时，直到四倍体囊胚开始发育。融合参数：DC：5v，10s；AC：50v，35us；两个循环。
准备供显微注射用的ips细胞
66 铺明胶：在6cm皿上铺2ml明胶。在培养箱中至少放30min（一般过夜）
67 当ips细胞准备传代时，去除明胶皿中的明胶。
68 消化ips细胞，离心， 200g 5min
69 用3mlES培养基重悬细胞，加到明胶皿中，在培养箱中培养1小时。MEF细胞会轻轻依附在明胶上，但是ips细胞不会。
70 轻轻摇动皿，将上清慢慢转到15ml离心管中，避免夹有依附的MEF细胞。
71 200g离心5min 去上清
72 用30ul的ES培养基重悬细胞
73 将细胞转移到1.5ml的EP管中， 冰上放置30min。
注射和之后的培养
74 将四倍体囊胚（注射hcG94-98小时后）转到用矿物油包裹的H-CZB培养基上。
75 保留四倍体囊胚体靠近内细胞团附近的部分。
76 在显微注射管中收集10-15个圆形的ips细胞。
77 将显微注射管移到两个滋养层细胞之间的区域
78 通过脉冲钻孔将显微注射管通过通过透明带和滋养外胚层。
79 释放所有的ES细胞到囊胚腔
80 将注射了ES细胞的囊胚腔重新移到CZB培养基中。
81 将10-12个注射过的囊胚转移到的CD-1的小鼠子宫角中。
82 胚胎植入17天后观察幼畜分娩结果。
83 通过基因和分子检测证实获得的小鼠来自于四倍体嵌合体ips系。
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