中国医科大学
博士学位论文
山莨菪碱对脑缺血再灌注损伤微循环的影响及在逆行灌注脑保 护中的作用
姓名：***
申请学位级别：博士
专业：外科学
指导教师：***
2000.4.1
摘要
气形态手诊
ｆ前言
深低温停循环作为对供给脑血液的主要血管进行手术时的脑保护手段 并显在婴魏，０玉箍手术以及主动脉癣手术融取褥了缀大的成续，瞧是，从
脑保护的观点上看，不能说是最安全的方法。因此我们需要得到～种更科
学、更安全豁脑傈护方法。在低体滏箨循琢法静基稿匕选择性腻灌注法裙
逆行ｆ生脑灌注法更有剁于脑保护。从实验的结果看，近似生理的顺行性脑
灌注法，安全性最高；逆行程脑灌注法由予维持长时闯的代诱ｌ骞潮难，其
然而，在主动脉瘤临床实践中，尤其怒主动脉弓部的病变，常常累及
激点文学头臂血管，用ＪＩ目珩性脑灌注法进行脑保护是不可能的，此时不得不用逆行
性脑灌注法进行脑保护。逆行陛脑灌注法藏然受时间因素的制约，但是它
可以提供良好的手术视野，使动脉瘸鸯芝被彻底的切除并缩短手术操｛乍时间，
这又可弥补逆行陛脑灌注法的不足。如果谯逆行睫脑灌注法的基础上，蒋
加上药物的保护传用，骞基提癌腱保护鳇安全性，楚最理想的方法。
山莨菪碱是从莨蒋类植物中分离、提纯的一种抗胆碱药，广泛应用于
挽孛毒性铼髭耧其它疾病懿。横究涯甓，出焚菪碱蠡茏挪毒ｌ巍栓素Ａ２
（ＴＸＡ２）的合成、粒细胞和血小板的聚集；另一方面作为细胞保护剂的山
蓑菪躐鸯薯够产生钙离子接藏作焉，稳定线糠体帮溶酶俸骥，保护激活的多
核粒细胞，减少氧自由基的释放，从而降低红细胞膜的脂质过氧化作用，
微型燃气轮机
缓解巍液流交性静异常，巯邋微循环，减轻组织编翘的损伤，同时还其存
保护血管内皮细胞和血脑屏障的功能。山莨菪碱影响ＮＯ代谢可能与其抗
疆碱佟用及刚氐血浆ｃＧＭＰ含量和钙拮抗作用有关。
逆行性脑灌注法作为体外循环下深低疆序循环时的脑保护法的有效手
段应用到了临床。关于逆行陛脑灌、注下脑循环的研究报告很多，但是，在／荧光．要微镜壹视下磷究出甍磐碱对脑微小德环的作愿还未见报道。Ｉ本研究
长春新文化报
应用大鼠脑缺血模型、微循环模型及ｃｌｏｓｅｄｃｒａｎｉａｌｗｉｎｄｏｗ模型探讨山莨菪碱对大鼠脑缺虚再漾洼损伤、盘滚流变学以及逆｛亍蛙脑灌注时脑微小循环
的保护作用。
蜜验豺将
《１。窦狻动物
＼ｋ糍Ｗｉｓｔａｒ大鼠（２００～３００９），囊基本实验滋物会社（株）提供。２＋主要药晶及敌器
懿酸由莲装碱；溅梅５ｍｇ／ｍｌ（：｛毫裳褰《翡厂，￥魄号９７０９２８３）。Ｂｅｃｋｍａｎ
Ｌ－９８００鹫滚体阕烁计数纹，强壹Ｆ－４０００受荧悲分竞港赛计。ＭＣ－－－ＦＡＮ徽逶道溪ｌ定装麓（医鼗篆嚼惑予），｛慕溢离心机，诗时器（ＳＥＩＫＯ精舔赛为
１／ｔ０００移）。授瓣壁荧巍活体鬟徽镳（搁委∞ＮＸＦ－－－ＥＦＤ２，辫１０、２０、６０
铰链结构
１Ｖ照豫系绕（挂燃ＡＭ熊辍ｉｃ２４００）彀谐长煞耨镜），越高感度ｓｒｒ
ＶＨＳ录像系统等。
实骚方法
ｔ脑缺盘褥灌注模型的建立
纛震双颈魂弥络挽办法，徽成臆缺褥灌注模黧；期甩稚动脉烧终淡徽成突金骆缺巍模型。
２实验是密
（１）藏映照露灌注损伤时大簸缓织中ＮＯＳ、ＮＯ及ＥＴ晌蹙傀。
将雄缝Ｗｉｓｔ糕大鬣｜涟貌分戏空鑫对照缀缓缀≥、缺盘缀（Ｂ缀）釉缺叁懿羧靛瀵射囊蕉菪碱鳃（Ｃ缝）。Ｃ女蓬分淹Ｃ，缀（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｑ缀００ｍｇ，ｋｇ）黎镪筑（４０ｍｇ／ｋｇ），每缀ｌｏ灵。宠全蕊缺逡模型缱靛盘时阗为１０分锋，爵灌注时润必３０分锋；不巍全藏缺斑模黧缀缺懿时阉秀３０分静，蒜灌漫游阙蕊３０努铮。Ｃ缀在凝巍瓣羧黢内注射由莨蓉碱，Ａ、塾缝壤麓内注鸯誊褶褥容量豹生理盐水。
器缰大鼠分菇ｇ予脑缺盎蓐器灌注开娩疑番港隧３０分瓣辩瞬头楚延，采
取大耱右顶时皮瑶缝织和颈静咏血液，置≮气３０。Ｃ冰箱中裸存待测。
藏组织ＮＯＳ活性测定鞘ｌＮＯＳ放封凳囊溅定药盎（Ｓｉｇｍａ公裁），参照Ｂｒｅｄｔ簿方法，所有攥｛乍蚜燕ｏ～４℃下进行。称取冻簸组织（右颈时皮层），技１：５（ｗ／ｖ）ｅ毫铡秀鞋入颚冷的ＢｕｆｆｅｒＡ（５０ｍＭＨｅｐｅｓ，ＰＨ７；４，０。３２Ｍ煮潞，ｌｍＭＥＤＴＡ，０。ｌｍＭＥＧＴＡ，ｔｍＭＰＭＳＦ，ｔｍＭＭＤＴｒ，ｌｔａＭＬｅｕｐｅｔｉｎ，２９Ｍｌ＇ｅｐｓｔａ斟。豢漆涤中溺玻璃匀浆器匀浆，萄§（碡℃，２０００９）６０１嫩＇１，上淹卵建ＮＯＳ攥取液，取５０≯１ＮＯＳ掇淑泼，糖入５§鞋ｌ爱应ＢｕｆｆｅｒＢ（５０ｍＭＨｅｐｅｓＰＨ７Ａ，０。１ｍＭＮＡＤＰＨ，３蛰箨ＭＢ麓，１０ｎＭＣａＭ，１．２５ｍＩｖｌ
２
ＣａＣＩａ，ｌｍＭＥＧＴＡ，０．２ＩａＣｉ薯｛＿．精氨酸）。反应管中加入ｌｍＭＬ＿ｎｉ晌——崤
作为本底，３７℃永浴中反应１５ｍ洫，照２烈预冷的ＢｕｆｆｅｒＣ（２０ＭＨｅｐｅｓ，ＰＨ５．５，２ｍＭＥＤＴＡ，０．２ｍＭＥＧＴＡ，ｌｍＭ卜—ｃｉｔ）终止反应。再经０．５～０．７ｍｌＤｏｗｅｘ５０ＷＸ８（心型）阳离子交换树舅鬟层孝厅楗分离反应液中的３珏～流出液和２ｍｌ的的蒸馏水洗脱液。将收集的样品混匀后取出ｌｍｌ于闪烁杯中，鸯§入甲苯—ｌ巍醮Ｘ—ｌ∞闪烁滚７ｍｌ。在渡体闪烁｛＝｝‘数仪￡：ｌ鬟｜｜定鲢中的放射性活性。由此计算出３Ｈ－—胍氨酸的生成量。结合蛋白质浓度计算ＮＯＳ酶眈活髓。
Ｎ０２的测定，参照Ｏｈｔａ等的方法，称取冻脑组织１００ｍｇ，加入３ｍｌ预冷的１００ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钾缓？辛液中（含１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，鞭｛７．５），锖ｌ成匀浆。离心（４℃，４０００ｒｐｍ／ｍｉｎ）１０ｍｉｎ。取上清液２ｍｌ，加入０．０４％４．羟褥豆素（用二甲基甲酰胺与２Ｎ盐酸ｌｊｌ混合配制）Ｉｒｎｌ，Ｏ℃放置５ｒｎｉｎ。褥掘入８％ｊ燃酸钠１００ｐ
１，室温放爨５ｍｉｎ。加入１．５ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨｌｍｌ，置爨盈１０ｍｉｎ。用日立Ｆ－删型荧光分光光度计澳ｌ定样鼎的荧光强度。
以ＮａＮ０２作橡准兹线，结合蛋自袋浓度计算ＮＯｚ的含量。
组织蛋白质测定：采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法。
ＥＴ静测定，大鼠懒全盘２ｍｌ，注入含１０％ＥＤＴＡＮａ２３０＃ｌ露搀行医
肽酶４０ｕｌ的试管中，低温离心血浆。取缺斑区脑组织１００ｍｇ左右，加入ｌｍｏｌ／Ｌ豹醋酸１ｍｌ峪俸碾黪，ｌ∞℃求浴中煮沸１０ｒａｉｎ，匀浆。低潺离洛１５ｍｉｎ，取上清液同血浆置于一３０℃冰箱保存待测。采用ＥＴ放射免疫药禽（ｓｉｇｍａ公司）阕｝｝｝凝ｌ定。
（２）用微通道方法测定大鼠脑缺血再灌注损伤后血液流变学的变化。
将大鼠分为对照组（Ａ组）和实验组（Ｂ组）。Ｂ组在阻断双德ＣＣＡ时腹睃内注射山莨菪碱（３０ｍｇ／ｋｇ），Ａ组凌射相同容积的生理盐水。每组１５只。
聪组分别予阻断双侧ＣＣＡ前、阻断ＣＣＡ３０分钟开放时和薅灌注３０分钟时各断头５只从颈静脉取血２ｍｌ。取血用肝素抗凝（肝索：血液踟．５：９．５）。低温黪３０００ｒｐｍ１０ｍｉｎ，
髑自身的斑浆将全盘的Ｈｔ调至３３％。然瑟测定ｌＯＯｇｌ全血通过微通道的时间。首先测定１００Ｉ＿ｔｌ生理盐水在２０ｃｍＨ２０柱压差下的逶过时闽；然后测定ｌ∞瓣全盘通过时闻，结果题生理盐水透避时间矫正。
矫正式（ｓｅｃ／１００肛１）＝全血通过时间×１２秒÷生理盐水通过的时间（１２秒荛生理盐水通过时间的标≯赡）。
（３）应用活体荧光显微镜直接观察山莨菪碱对脑缺血再灌注损伤时的微小锤繇变化影嚷。
随机将大鼠分为顺行灌注组和逆行灌注组，两组分别分为对照组（Ａ组）和实验缀（Ｂ组）。Ｂ缝阻羧双侧ＣＣＡ时腹腔痰注隽圣出莨蓉碱（３０ｍｇ／ｋｇ），Ａ组注射相同容量的生理盐水。每组１０只。
接Ｍｏｒｉｉ簿的方法，隶ｌ备ｃｌｏｓｅｄｃｒａｎｉａｌｗｉｎｄｏｗ。嚣ｌ把头部固定后，从头后部到前部纵行切开皮肤，露出颅骨，把右侧顶部颅骨切除约ｌｃｍ直径大小，用细针细心剥摔硬脑膜，将～直径１．５ｃｍ，篱０，５ｃｍ塑料琢（壁上连有二根内裰１．３ｍｍ的输液管，可通过人工脑脊液）扣在切除的颅骨周围，上盖Ｏ．Ｉｍｍ玻璃盖，然后甩合成树脂封闭该窗并随定在颅骨
上。这样，颅内压就可用人工脑脊液的静水压随时调节了。人工脑脊液阁９５％０２＋５％Ｃ０２气体饱和处理。观察动脉皿流速度时选择大脑中动脉的分支（盘篝直径２５～５０ｕｍ），观察豁脉盘流速度时选择大脑上静脉的分支（血管直径５０～９０“ｍ）。每次读取５组数据，取平均值。顺行灌注组分男ｌ在阻甑ＣＣＡ裁、隧凝ＣＣＡ３０分镑开放辩，心内泣入Ｏ。０１％Ｆｒ聪磋堍聪ｎ０．１ｍｌ；逆行灌注组在阻断ＣＣＡ３０分钟蔗切开升主动脉，停止循环，以Ｏ．０ｌ嘲闲陀翻§鞭速与盐求懿混合物为灌流液，溺注鸯量泵从颈乡｝静脉逆行灌注；两组均通过ｗｉｎｄｏｗ用投射荧光显微镜观察微小动静脉血管内液体流动速发。
（４）统计学处理：实验结果以Ｘ±ＳＤ表示，组间差别的显著性用ｔ检验，ｐ＜０．０５有意义。
实验结果
ｌ脑缺血褥灌注后，对照组ＮＯＳ、ＮＯ及ＥＴ均明显升高（ｐ＜ｏ．０１），山莨戆碱应用组明显降低（ｐ＜０．０１）。
２血液通过微通道的时间（ｓｅｃ／１００Ｉ．ｔ１）。阻断ＣＣＡ前实验组为４８．０４±２。６４，对照组为４４。８５±２．３２，无差别（ｐ溜。０５）；阻叛ＣＣＡ３０ｒａｉｎ时，实验组为６４．４１±７．８６，对照组为７６．３３＋８．４１有盟著差别（ｐ＜０．０５）；再灌注３０ｍｉｎ瓣实验组必６６．１２－ｔ－１１。６５，对照级必１０２。８±１１。３５差另蝈＃鬻显著（ｐ
＜ｏ．０１）。对照组灌注３０ｍｉｎ血液通过微通道的时间明显长于阻断
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