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中国处方药 第16卷 第7期
·实验研究·
均逐渐趋向正常值，而对照组中的小白鼠的SMC 内LPO 指标为
22.3±0.1，SOD 指标为30.49±0.3，均处在异常且较高指标上，并且研究组小白鼠有效率为90%，对照组仅为10%，两组数据对比差异具有统计学意义（P ＜0.05）。因此，当归补血汤对动脉硬化病症有极好的疗效。参考文献
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苏锡常
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止痛、助阳止泻、降逆止呕等功效，能够用于厥阴头痛、寒疝腹痛、脘腹胀痛、五更泄泻等疾病，且作用效果十分显著[1]，此外，在口疮以及高血压外治中，效果也比较突出。吴茱萸中包含化学成分类型相对多样，其中以生物碱与柠檬苦素类化合物为主要有效成分；而生物碱中又以吴茱萸碱、吴茱萸次碱为主，在镇痛、止呕、抗炎、强心、血管扩张上作用功效显著，同时吴茱萸
次碱还能够抵抗胃黏膜损伤[2]
。本研究对HPLC 法测定吴茱萸中吴茱萸碱与吴茱萸次碱含量进行研究，以供参考。1 仪器与试剂 本次实验使用仪器为Agilent1220型高效液相谱仪、Agilent 紫外检测器以及EclipseXDB-C 18谱柱（250 mm ×4.6 mm ，5 μm ）、
HH-2数显恒温水浴锅、MettlerAE240电子天平、KQ318T 型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司生
产）等，此外，实验试剂为吴茱萸碱、吴茱萸次碱对照品（均由成都彼祥生物科技有限公司购买，纯度≥98%）；实验使用甲醇、乙醇、乙酸乙酯为分析纯[3]，乙腈为谱纯[4]，还包括纯化水、吴茱萸（产自江西新干县）等。其中，吴茱萸经鉴定为真品[5]。2 方法与结果
2.1 HPLC 法条件检测实验中，谱柱为EclipseXDB-C 18（250 mm ×4.6 mm ，5 μm ），流动相为乙腈-水（51∶49），流速为1.0 mL/min ，柱温为30℃，检测波长为290 nm ，进行吴茱萸中吴茱萸碱与吴茱萸次碱含量检测。
2.2 溶液制备
对照品溶液制备：分别提取吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品2.5 mg ，加甲醇进行溶解并定容为25 mL ，制成吴茱萸碱与吴茱萸次碱浓度均为0.1 mg/mL 的溶液后备用。
实验分析样品溶液制备：首先将吴茱萸粉碎成末状后，精确称取1 g 吴茱萸粉末并加入10倍的甲醇后，以80℃条件进行回流提取两次，其中，第一次加入6倍的甲醇，回流提取时间设定为2 h ，第二次加入4倍甲醇，回流提取时间设定为1 h ，完成后进行放置冷却并使用0.45 μm 滤膜进行滤过，进样量设置为10 μL 。
2.3 方法特异性考察
邻苯二甲酸酯
吴茱萸碱与吴茱萸次碱对照品溶液、吴茱萸样品溶液的HPLC 谱图如下图1所示，根据该图中三种成分的谱图的
HPLC 法测定吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量
缪昌文
（泰州市姜堰中医院，江苏泰州 225500）
【摘要】目的 对HPLC
法测定吴茱萸中吴茱萸碱与吴茱萸次碱含量的可行性进行验证。方法 采用HPLC 法，谱柱为EclipseXDB-C 18（250 mm ×4.6 mm ，5 μm ），流动相为乙腈-水（51∶49），流速为1.0 mL/min ，
柱温为30℃，检测波长为290 nm ，进行吴茱萸中吴茱萸碱与吴茱萸次碱含量检测。结果 吴茱萸碱与吴茱萸次碱在浓度为5.38～53.80 μg/mL 、5.02～50.20 μg/mL 范围内与其峰面积积分分值之间呈良好线性关系，并且其
平均加样回收率达到99.82%和98.49%。结论 HPLC 法检测吴茱萸中吴茱萸碱与吴茱萸次碱含量不仅操作简便，并且具有可重复性，能够用于吴茱萸质量检测与控制。
【关键词】HPLC ；吴茱萸碱；吴茱萸次碱；含量测定
液制备
法特异性考察（1）吴茱萸碱对照品溶液HPLC 检测谱图
液制备
法特异性考察
（2）吴茱萸次碱对照品溶液HPLC 检测谱图
图1：吴茱萸碱和吴茱萸次碱HPLC 检测谱图
（3）吴茱萸样品溶液HPLC 检测谱图准曲线制备
41 Journal of China Prescription Drug Vol.16 No.7·实验研究·
谱峰值变化可以看出，在HPLC检测中能够根据其谱峰值
变化实现不同成分的完全分离与检测分析，因此，HPLC法进行
静穆吴茱萸中吴茱萸碱、吴茱萸次碱检测具有可行性。
2.4 标准曲线制备
按照上述方法制备的吴茱萸碱、吴茱萸次碱对照品溶液以及
样品容量，首先进行精密量取0.5、1、2、3、4、5 mL的对照品溶液加
中国知行网>学苑追艳录入甲醇进行稀释定容至10 mL后摇匀，然后以波长为290 nm的HPLC法检测条件对吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量进行检验，并对其线性关系进行考察，检测时对照品容量进样量设置为10 μL。
根据上述实验方法，在以对照品进样量为横坐标、峰面积为纵坐标进行曲线绘制并进行回归方程计算[6]，以实现线性关系考察研究结果显示：吴茱萸碱与吴茱萸次碱的回归计算方程分别为Y＝1 127.4 X
＋2.913 4（r2＝0.999 6）、Y＝914.7X-9.952 3（r2＝0.999 5），经计算分析可知吴茱萸碱与吴茱萸次碱在5.38～53.80 μg/mL、5.02～50.20 μg/mL范围内与其峰面积积分分值之间呈良好线性关系。
2.5 重复性与稳定性考察
采用同一份吴茱萸药材，按照上述“2.2”的溶液制备方法，进行平行制备6份试验溶液，并按照“2.1” HPLC法条件以每份试验溶液进样10μL后进行峰面积记录与RSD计算，以对其重复性进行评价，结果显示吴茱萸碱与吴茱萸次碱峰面积RSD为2.07%和1.84%，这一结果表明HPLC法测定吴茱萸碱与吴茱萸次碱的重复性较好。
同理，将同一份吴茱萸药材进行试验溶液制备完成后，按照上述“2.1”HPLC法条件在0、2、4、6、8、12 h等不同时间段进行进样检测分析，对其峰面积变化及RSD值进行计算分析，对本次实验的稳定性进行评价，结果显示吴茱萸碱与吴茱萸次碱峰面积RSD值为1.56%和1.82%，表明试验12 h稳定性较为显著。
2.6 加样回收试验结果
加样回收试验通过在样品溶液中加入对照品，以避免吴茱萸碱与吴茱萸次碱对照品直接加入样品导致对提取造成影响，产生加样回收误差情况。具体方法为：将已知浓度的吴茱萸药材试验溶液精确量取
三份，然后按照不同比例进行吴茱萸碱与吴茱萸次碱对照品加入，并根据HPLC法条件连续进样三次进行测定分析，以对平均回收率进行计算。结果显示，吴茱萸碱在加入80%、100%与120%对应含量对照品溶液后的平均回收率为99.82%，而吴茱萸次碱在加入80%、100%与120%对应含量对照品溶液后的平均回收率为98.49%。
2.7 样品含量测定
此外，吴茱萸样品中吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量测定，以精确量取1 g吴茱萸样品按照上述方法进行样品溶液制备后，根据HPLC法条件，对样品溶液中吴茱萸碱、吴茱萸次碱的平均峰面积进行测定，并根据峰面积测量结果进行含量计算。在对吴茱萸样品的吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量测定中，根据外标法通过上述实验对吴茱萸碱以及吴茱萸次碱含量进行计算分析[7]，其结果见表1所示。
根据上表中对吴茱萸样品中吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量测定结果，根据中国药典（2015版）中对吴茱萸药材中吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量要求标准可以看出[8]，本次检测吴茱萸样品中吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量符合其不少于0.20%的要求。
3 讨论
根据上述对吴茱萸中吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量的HPLC
测定实验分析，可以看出，采用HPLC法进行其含量测定中，流动相采用乙腈-水系统，然后以谱柱EclipseXDB-C18为（250 mm×4.6mm，5 μm）条件下，分别用乙腈-水（51∶49）、乙腈-水（47∶53）、乙腈-水（49∶51）作为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，在290 nm波长下进行检测分析，然后根据检测分析中检测品的分离度、分离时间等指标结果进行对比分析，最终显示以乙腈-水（51∶49）作为流动相系统用于上述吴茱萸中吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量HPLC测定效果最为理想，即流动相分离所需时间相对较短，且不同检测品的分离度较好。此外，对该HPLC法条件下的试验品溶液重复性、稳定性、特异性考察分析显示，其在12 h内稳定性较好，且对HPLC法检测的重复性与特异性验证可行，能够用于本批吴茱萸药材的吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量测定分析。
其次，上述对吴茱萸中吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量的HPLC 测定实验，以甲醇、乙醇以及乙酸乙酯等作为检测溶液的提取试剂[9-10]，用于吴茱萸生物碱提取实验和分析。需要注意的是，在对这几种提取溶剂进行吴茱萸生物碱提取率实验对比后显示，将甲醇作为提取溶剂进行吴茱萸生物碱提取的效率最高，同时针对不同提取溶剂用量以及不同提取环境、甲醇浓度、提取时间等对其提取效果的影响实验后，并根据实验结果进行正交试验分析，最终显示以80℃水浴条件下使用10倍量的100%甲醇对吴茱萸生物碱进行回流提取两次，总提取时间设计为3 h时，其提取的效果最为显著。
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表1：吴茱萸样品中吴茱萸碱与吴茱萸次碱含量检测结果
实验次数吴茱萸碱含量（%）吴茱萸次碱含量（%）
第一次实验0.1940.223
第二次实验0.1960.227
第三次实验0.1920.221三次实验平均含量0.1940.224
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