作者：毛 英 王 欢 游仙丹 等
来源：《农业开发与装备》 2016年第1期
毛 英1，王 欢2，游仙丹1，刘 思1，连 琰1*
（1.怀化学院化学与材料工程学院，湖南怀化 418000；2.湖南大学化学化工学院，湖南长沙 410083）
摘要：目的：研究中药材黄连中生物碱的HPLC测定方法。方法：采用BDS Hypersil C18谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；以乙腈、0.05mol·L-1磷酸二氢钾溶液（50：50）（每100ml中加十二烷基硫酸钠0.4g，再以磷酸调节pH值为4.0）为流动相；检测波长为345nm；流速：1.0ml·min-1；柱温：30℃；进样量：20μL。结果：盐酸小檗碱在0.3～1.2μg范围内呈良好的线性关系，R2＝0.9935（n＝5），加样回收实验的平均回收率达到100.41%，RSD＝1.2%（n＝9）。结论：该方法简便、准确、重现性好，可用于黄连药材中生物碱含量的控制方法。 关键词：高效液相谱法；黄连；生物碱；药理研究；盐酸小檗碱
0 引言
黄连为多年生毛茛科草本植物[1-2]，药用部分主要取自黄连、三角叶黄连、峨嵋山野连或云连的根茎[3]。野生黄连主要产于四川、云南、湖北，现今多采用荫棚栽培。秋季采挖，除去须根和泥沙，干燥。黄连作为临床常用药物，用于湿热痞满、呕吐吞酸、泻痢、黄疸、高热神昏、心火亢盛、心烦不寐、血热吐衄、目赤、牙痛、消渴、痈肿疔疮；外治湿疹、湿疮、耳道流脓等[4]。此外，黄连还具有很多药理作用譬如：抗病毒作用、抗阿米巴作用、抗炎、抗腹泻作用、对心血管作用、降血糖作用、降血脂作用、抗氧化作用、对血液系统的影响、抗溃疡作用[5-6]。
由于黄连的种类与炮制方法都非常多，地理分布也比较广泛，因此作为药材它们的质量不易控制。黄连的主要药用成份生物碱的含量的准确测定对评价不同产地黄连与质量监控具有重要意义。黄连生物碱含量测定的方法主要有高效液相谱法（HPLC）[7]、薄层扫描法（TLCS）与紫外分光光度法（UV）等，它也是一味具有广泛药效作用的中药，在国内外很多种疾病的都用到了它，且黄连新的药效又不断被发现。尤其是其是在抗癌、降血糖和改善心脑血管功能等方面均具有较好的药效[8-11]，越来越受到人们的重视，因此，对黄连进行深入研究，对黄连中的各种生物碱进行全面的分析，以开发生药资源，扩大其药效作用，将有很大的社会效益和广泛的开发前景。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
日本岛津LC-10AT高效液相谱仪、KQ-250DE型数控超声波清洗器、HH数显恒温水浴锅、上海电热鼓风干燥箱GZX-9070MBE、BL电子分析天平FA2204N、容量瓶（10ml、25ml）、烧杯、玻璃棒、移液管、漏斗、微孔滤膜（0.45μm）、移液；盐酸小檗碱化学对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号：110713-200208）纯度为98%，黄连（味连、过120网目筛）、乙腈均为谱纯，十二烷基硫酸钠、甲醇、磷酸二氢钾、磷酸、盐酸均为分析纯、水为蒸馏水。
1.2 对照品溶液的制备
对照品盐酸小檗碱在105℃下的烘箱中干燥至恒重，精密称取对照品约15.0mg，用甲醇溶解并定容到25.00ml，得对照品溶液的浓度为0.06mg·ml-1。
1.3 供试品溶液的制备
精密称取黄连粉末样品（过120目筛，80℃干燥）约50mg，加盐酸-甲醇（1：100）溶液45ml，60℃水浴锅中温浸15min，超声处理（功率250W，频率40KHz）30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，用普通滤纸滤过，取滤液，用0.45μm滤膜再次过滤，再定容与25ml容量瓶，即得供试品溶液。
1.4 液相谱分析条件
液相谱分析条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为谱柱的填充剂；以乙腈、0.05mol·L-1磷酸二氢钾溶液（V：V=50：50；每100ml中加十二烷基硫酸钠0.4g，再以磷酸调节pH值为4.0）为流动相；检测波长为345nm；流速：1.0ml·min-1；柱温：30℃；进样量：20μL。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5 000。
在此谱分析条件下，待谱基线走平后，分别精密吸取对照品溶液与样品溶液各20μL，注入液相谱仪，测定。
1.5 阴性对照试验
按照供试品溶液的制备方法制备不含黄连提取液的空白对照溶液，在上述相同的谱分析条件下，分别准确吸取对照品溶液、空白对照溶液、供试品溶液各20μL，分别注入液相谱仪。
1.6 提取工艺的研究实验
1.6.1 温浸时间的影响。精密称取13份黄连粉末样品（过120目筛，80℃干燥）均约50mg，分别加入盐酸—甲醇（1：100）溶液45ml，浸泡5min后，分别放入60℃水浴锅中温浸提取，温浸时间分别从0、5、10、15……60min，然后各样品溶液进行超声处理（功率250W）30min，放冷，再称定重
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量，用甲醇补足减失的重量，普通滤纸滤过，取滤液，再用0.45μm滤膜过滤，再用25.00ml容量瓶定容到25.00ml，即得提取样品。测量各样品生物碱的含量，确定最佳提取时间。
1.6.2 温浸温度的影响。精密称取5份黄连样品粉末（过120目筛，80℃干燥）重约50mg，分别加入盐酸—甲醇（1：100）溶液45ml，分别在25℃、40℃、60℃、80℃、100℃水浴锅中温浸提取15min，然后各样品溶液进行超声处理（功率250W，频率40KHz）30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀并用普通滤纸滤过，取续滤液，再用0.45μm滤膜过滤，再定容于25.00ml容量瓶，即得提取样品。测量各样品生物碱的含量，确定最佳提取温浸温度。
2 结果与分析
2.1 谱分析条件
在本实验选择的谱条件下分别检测对照样品溶液与样品溶液，测得谱图如图1。从图1中的样品谱图（图1A）、对照品谱图（图1B）来看，结果表明该谱条件适合黄连样品分析检测。
2.2 阴性对照实验结果
将空白溶液、供试品溶液、对照品溶液用进样器各抽取20μl，分别注入液相谱仪。谱分析实验结果如图2。从图2中曲线a可以看出：空白溶液对应的曲线a，在谱图中没有出现明显的谱峰；黄连样品曲线b中最大峰与曲线c的最大峰保留时间一致，表明，黄连样品中采用该提取方法能提取到小檗碱，且小檗碱在提取物中含量较高，且从峰形来看，其它成分对小檗碱的定量测定无干扰。
2.3 温浸时间分析结果
上海振华港机 黄连提取液中盐酸小檗碱的含量与水浴温浸提取时间的检测结果如图3所示。图3结果表明：随着水浴温浸提取时间的增加提取液中小檗碱的含量也快速增加，当温浸提取时间到15min时小檗碱的含量也达到最高值，温浸提取时间继续增加，提取液中小檗的含量趋平且略有下降。因此，提取黄连中生物碱的最佳温浸提取时间确定为15min。
势力范围
2.4 最佳提取温度
不同提取水浴温度下提取液中小檗碱的含量检测结果如图4所示。结果表明：随着水浴温度升高，提取液中小檗碱的含量也快速升高，当水浴温度升高到60℃时，小檗碱的含量达到最高，继续升高水
砝码检定浴温度后，小檗碱的含量含量反而逐渐降低，因此，提取黄连中生物碱的最佳温浸提取温度确定为60℃。
2.5 标准曲线的绘制
将配制好的浓度为0.06mg·ml-1盐酸小檗碱标准对照品溶液分别进样5μl，8μl，10μl，15μl，18μl，20μl，以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（A），绘制标准曲线，检测结果与标准曲线分别见表1与图5。标准曲线的回归方程为y=179842x-298324，R2=0.9911。由此可见在该检测方法下，小檗碱含量在0.3～1.2μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。
2.6 精密度的测定
取浓度为0.06mg·ml-1盐酸小檗碱对照品溶液，进样5次，检测盐酸小檗碱谱峰积分面积值，检测结果如表2。结果表明：5次检测的积分面积基本不变，计算RSD%为0.01%，该检测方法的精密度良好。
2.7 加样回收试验结果
精密称取已测含量的黄连粉末供试品9份各50mg，按1.3供试品溶液制备方法提取液，并定容到25ml后，摇匀，各精密量取5ml，其中1、2、3号各精密加入用甲醇配置的盐酸小檗碱对照品溶液（盐酸小檗碱浓度0.06mg·ml-1）1ml，4、5、6号各加入上述对照品溶液2ml，7、8、9号各精密加入上述溶液3ml，按供试品含量测定方法操作，测定每份供试品含量，得到加样回收率结果见表3。回收率在98%～101%之间，且RSD为1.2%，结果表明检测方法回收率好，方法准确可行。
2.8 样品含量测定
精密称取盐酸小檗碱对照品，配制成每1ml含0.06mg的溶液作为对照品溶液。分别吸取对照品溶液
和供试品溶液各20μl进样，按外标法计算盐酸小檗碱的含量。
根据参考文献，确定黄连中生物碱的种类，并将盐酸小檗碱作为内标物质来计算生物碱的含量。
3 结语
为了精确测定黄连中生物碱的含量，文中建立了应用高效液相谱检测法，以及结合外标与内标法对黄连提取液中的五种生物碱的含量进行定量测定与分析。同时通过实验探索了提取黄连生物碱的条件。所采用的高效液相谱条件不仅能够排除非生物碱成分的干扰，还能将盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸表小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱完全分离，该方法操作简单，结果准确。在经过一系列的方法学考察后，结果表明此检测方法可用于黄连生物碱的质量控制。
参考文献
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[4] 刘晓琰.复方黄连与黄连素的临床应用及研究新进展[J].社区医学杂志，2015，13（6）：92.
[5] 刘腾飞，陈四玉，刘翠艳.黄连不同的炮制方法和制剂工艺体外抑菌作用的比较研究[J].中国中医药科技，2015，（1）：46-48.
[6] 陈亚楠，袁玲.黄连根茎浸提物对绿藻的毒理作用[J].环境科学，2015，（5）：20.
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[8] 李云，王炜，尹登科，等.黄连多糖不同组分抗氧化活性比较研究[J].安徽中医药大学学报，2015，34（1）：66-69.
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